本文關(guān)鍵詞：Tim-3融合蛋白的免疫干預(yù)作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景Tim-3起初發(fā)現(xiàn)表達(dá)于活化的CD4+Th1,Th17,CD8+Tc1細(xì)胞上,并通過負(fù)性調(diào)控上述細(xì)胞的功能維持免疫耐受。然而,隨后的數(shù)據(jù)顯示Tim-3在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等參與天然免疫應(yīng)答的細(xì)胞上也有表達(dá),并可調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)。Tim-3在天然免疫及獲得性免疫中的重要作用使其在許多免疫相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制中具有一定的影響力。在適應(yīng)性免疫方面,已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在許多疾病中表達(dá)異常。多發(fā)性硬化癥患者T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)顯著降低,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中有狼瘡腎炎的Tim-3的m RNA水平明顯低于那些沒有狼瘡腎炎的。這些發(fā)現(xiàn)表明Tim-3通路可能在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。另外Tim-3也與多種腫瘤疾病相關(guān)。在大量的前列腺樣本中發(fā)現(xiàn),從前列腺上皮內(nèi)瘤到局部前列腺癌再到轉(zhuǎn)移性前列腺癌中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上Tim-3的水平不斷升高,與此相似在宮頸癌及胃癌患者體內(nèi)高水平的Tim-3均提示了預(yù)后較差。另外,Tim-3與感染的關(guān)系也有不少的研究。研究發(fā)現(xiàn)HIV-1感染個(gè)體中T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平對與HIV-1病毒載量成正相關(guān);流感病毒感染后肺部的T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)增加,類似現(xiàn)象還有很多,如慢性丙型肝炎病毒感染和HSV感染后T細(xì)胞也發(fā)生Tim-3的表達(dá)上調(diào)。在Tim-3與疾病的研究中發(fā)現(xiàn)其也與天然免疫細(xì)胞有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠免疫誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的CD11b+單核細(xì)胞和固有小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上Tim-3上調(diào)。ITP患者外周血和脾臟中的單核細(xì)胞上Tim-3的m RNA表達(dá)與對照組相比顯著降低。但相對于獲得性免疫,疾病中Tim-3在天然免疫細(xì)胞上的表達(dá)情況尚缺乏深入研究。機(jī)制也需要進(jìn)一步的探討�；赥im-3在多種疾病中表達(dá)失常,所以針對Tim-3采取的疾病干預(yù)策略也逐漸受到關(guān)注。例如使用Tim-3的配體galectin-9治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎,可選擇地減少IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量,使疾病得到改善,暗示了Tim-3激動性抗體對自身免疫病可能有治療作用。Chiba等人的研究表明,在皮下結(jié)腸腫瘤模型中,使用抗Tim-3抗體能增強(qiáng)化療藥物CDDP的抗腫瘤效果。Dardalhon和同事發(fā)現(xiàn)抗Tim-3單抗抑制皮下移植瘤EL4淋巴瘤的生長。R.Brad等人使用重組可溶性Tim-3阻斷Tim-3通路后HIV-1特異性T細(xì)胞的功能增強(qiáng),抗Tim-3抗體也得到了同樣的結(jié)果。Lucy等的研究表明使用抗Tim-3抗體可以促進(jìn)CD4+和CD8+HCV特異性T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子的分泌。以上充分證明了Tim-3在自身免疫病、腫瘤及慢性感染性疾病中的重要作用,及干預(yù)Tim-3通路后可影響這些疾病的進(jìn)程。但目前尚沒有成熟的干預(yù)藥物問世。因此,我們制備了Tim-3融合蛋白以便深入研究Tim-3干預(yù)對疾病的影響及對天然免疫細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。目的制備人、鼠Tim-3融合蛋白,驗(yàn)證其體外、體內(nèi)活性,初步探討Tim-3干預(yù)后對天然免疫機(jī)制的影響。方法1.原核表達(dá)Tim-3融合蛋白并進(jìn)行純化。2.體外評價(jià)Tim-3融合蛋白的生物學(xué)活性:分別阻斷巨噬細(xì)胞系RAW264.7及U937,腫瘤患者PBMC及腫瘤患者外周血細(xì)胞,檢測炎癥性因子水平的變化,驗(yàn)證體外活性。3.對Tim-3融合蛋白的體內(nèi)活性進(jìn)行評價(jià)a.首先建立Tim-3的轉(zhuǎn)基因小鼠的百草枯中毒模型證明Tim-3可減輕PQ中毒引起的炎癥損傷,然后使用Tim-3融合蛋白進(jìn)行干預(yù)觀察其是否加重炎癥反應(yīng);b.建立CT26結(jié)腸癌小鼠移植瘤模型,使用Tim-3融合蛋白進(jìn)行干預(yù),觀察其對腫瘤生長的影響,檢測對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響。4.建立更加符合腸道腫瘤生理狀態(tài)的CAC模型并使用巨噬細(xì)胞系,初步探索Tim-3影響巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。結(jié)果1.我們成功制備了人、鼠Tim-3融合蛋白。2.對Tim-3融合蛋白進(jìn)行體外活性評價(jià),發(fā)現(xiàn)其能競爭性阻斷巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面Tim-3與其配體的相互作用,增加IL-6、IL-8的分泌,且人、鼠Tim-3融合蛋白之間具有交叉反應(yīng)性;對腫瘤患者PBMC及腫瘤患者外周血細(xì)胞上Tim-3的信號均發(fā)揮阻斷作用。3a.PQ中毒后Tim3-轉(zhuǎn)基因小鼠較野生型小鼠表現(xiàn)出較輕的炎性損傷,提示Tim-3是一重要的免疫反應(yīng)負(fù)性調(diào)控蛋白,而用Tim-3融合蛋白阻斷Tim-3信號后,PQ中毒小鼠的免疫反應(yīng)及炎癥損傷進(jìn)一步加重。3b.Tim-3融合蛋白可明顯抑制移植瘤的增長,且干預(yù)后誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)向抗腫瘤的M1方向極化。4.機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Tim-3抑制細(xì)胞內(nèi)Stat1磷酸化水平,同時(shí)促進(jìn)表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的KDM6a的表達(dá),初步解釋了Tim-3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制。結(jié)論1.制備的Tim-3融合蛋白在體內(nèi)、外均有生物學(xué)活性。2.Tim-3高表達(dá)導(dǎo)致PQ中毒小鼠炎癥反應(yīng)減輕,表明Tim-3在維持炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)控功能;Tim-3融合蛋白在PQ中毒小鼠體內(nèi)阻斷Tim-3通路進(jìn)一步加重了免疫炎癥反應(yīng),該結(jié)果提示我們制備的融合蛋白具有顯著的免疫及炎癥反應(yīng)調(diào)控功能。3.Tim-3融合蛋白干預(yù)可以在體內(nèi)抑制腸腫瘤的生長,誘導(dǎo)腸道巨噬細(xì)胞向抗腫瘤的M1方向的極化。4.從胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和表觀遺傳修飾角度初步探討了Tim-3影響炎癥反應(yīng)的機(jī)制,初步發(fā)現(xiàn)Tim-3可能通過抑制Stat1的磷酸化、上調(diào)KDM6a的表達(dá)水平來調(diào)控巨噬細(xì)胞極化過程。
【關(guān)鍵詞】：Tim-3融合蛋白 移植瘤 PQ中毒 巨噬細(xì)胞極化
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 縮略詞表10-15
• 引言15-17
• 第一部分 Tim-3 融合蛋白的制備17-27
• 1.1 引言17
• 1.2 材料和設(shè)備17-18
• 1.2.1 試劑17
• 1.2.2 設(shè)備17-18
• 1.3 方法18-22
• 1.3.1 構(gòu)建人Tim3 p ET28a(+)重組載體18-19
• 1.3.2 轉(zhuǎn)化19
• 1.3.3 純化蛋白19-21
• 1.3.4 去除蛋白中的內(nèi)毒素21
• 1.3.5 蛋白定量（按照BCA蛋白定量試劑盒操作）21
• 1.3.6 檢測內(nèi)毒素21-22
• 1.4 結(jié)果22-24
• 1.4.1 小鼠Tim3Trx融合蛋白驗(yàn)證22
• 1.4.2 人Tim3Fc融合蛋白鑒定22-24
• 小結(jié)24
• 1.5 討論24-27
• 第二部分 人鼠Tim-3 融合蛋白的交叉反應(yīng)活性及Tim-3 融合蛋白活性的體外評價(jià)27-35
• 2.1 引言27
• 2.2 材料和設(shè)備27-28
• 2.2.1 試劑27
• 2.2.2 設(shè)備27
• 2.2.3 細(xì)胞27-28
• 2.3 方法28-30
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)28
• 2.3.2 細(xì)胞的凍存28
• 2.3.3 ELISA檢測28-29
• 2.3.4 分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞29
• 2.3.5 RNA提取29
• 2.3.6 反轉(zhuǎn)錄29
• 2.3.7 熒光定量PCR29-30
• 2.3.8 引物序列30
• 2.3.9 統(tǒng)計(jì)分析30
• 2.4 結(jié)果30-33
• 2.4.1 融合蛋白的阻斷活性30-31
• 2.4.2 人、鼠Tim-3 融合蛋白的交叉反應(yīng)活性31
• 2.4.3 Tim-3 融合蛋白活性的體外評價(jià)31-32
• 小結(jié)32-33
• 2.5 討論33-35
• 第三部分 Tim-3 在小鼠PQ模型中的作用及機(jī)制35-43
• 3.1 引言35
• 3.2 材料和設(shè)備35-36
• 3.2.1 動物35-36
• 3.2.2 試劑36
• 3.2.3 設(shè)備36
• 3.3 方法36-37
• 3.3.1 建立Tim-3 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠的PQ模型36
• 3.3.2 建立Tim-3 阻斷的PQ模型36
• 3.3.3 引物序列36-37
• 3.3.4 統(tǒng)計(jì)分析37
• 3.4 結(jié)果37-40
• 3.4.1 在Tim-3 轉(zhuǎn)基因小鼠中，PQ中毒所引發(fā)的癥狀及炎癥損傷減輕37-39
• 3.4.2 阻斷Tim-3 通路加重PQ中毒小鼠的癥狀39-40
• 小結(jié)40
• 3.5 討論40-43
• 第四部分 Tim-3 融合蛋白在小鼠移植瘤模型中的作用及機(jī)制43-51
• 4.1 引言43
• 4.2 材料和設(shè)備43-44
• 4.2.1 動物及細(xì)胞43
• 4.2.2 試劑43-44
• 4.2.3 設(shè)備44
• 4.3 方法44-46
• 4.3.1 CT26細(xì)胞培養(yǎng)44
• 4.3.2 麻醉藥的配置44
• 4.3.3 建立小鼠荷瘤模型并使用融合蛋白干預(yù)44
• 4.3.4 分離小鼠脾臟中細(xì)胞44
• 4.3.5 分離小鼠腫瘤浸潤單個(gè)核細(xì)胞44-45
• 4.3.6 引物序列45
• 4.3.7 流式細(xì)胞術(shù)（FACS）45-46
• 4.3.8 統(tǒng)計(jì)分析46
• 4.4 結(jié)果46-48
• 4.4.1 阻斷Tim-3 信號通路后腫瘤生長受到抑制46-47
• 4.4.2 阻斷Tim-3 信號通路影響移植瘤小鼠機(jī)制的初步探討47-48
• 小結(jié)48
• 4.5 討論48-51
• 第五部分 Tim-3 融合蛋白干預(yù)天然免疫機(jī)制的初步探討51-57
• 5.1 引言51
• 5.2 材料和設(shè)備51
• 5.2.1 試劑51
• 5.2.2 設(shè)備51
• 5.2.3 細(xì)胞51
• 5.3 方法51-53
• 5.3.1 建立CAC小鼠模型51-52
• 5.3.2 小鼠結(jié)直腸巨噬細(xì)胞的分離52
• 5.3.3 Western blot52-53
• 5.3.4 引物序列53
• 5.3.5 統(tǒng)計(jì)分析53
• 5.4 結(jié)果53-55
• 5.4.1 腸癌中巨噬細(xì)胞Stat1的磷酸化受抑制53
• 5.4.2 增強(qiáng)Tim-3 通路后進(jìn)一步腸癌中巨噬細(xì)胞Stat1的磷酸化53-54
• 5.4.3 Tim-3 與KDM6a54
• 小結(jié)54-55
• 5.5 討論55-57
• 結(jié)論57-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 綜述61-73
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 碩士期間獲得成果73-75
• 致謝75-77

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  本文關(guān)鍵詞：Tim-3融合蛋白的免疫干預(yù)作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：356301