目的骨髓基質干細胞向成骨細胞和脂肪細胞的定向分化成平衡關系,一旦平衡被打破會導致骨代謝相關疾病的發(fā)生。骨髓基質干細胞分化具有很復雜的分子機制,涉及到多個相關基因和信號通路的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調控也參與到骨髓基質干細胞分化調控中并發(fā)揮了重要的作用,但具體機制尚未研究清楚。本研究選取組蛋白去甲基化酶KDM4A（lysine-specific demethylase4A）作為研究對象,分別從功能、機制和動物實驗深入探討其對骨髓基質干細胞分化的調控作用及相關分子機制。方法1、實時熒光PCR（q RT-PCR）檢測小鼠各個組織中Kdm4a的m RNA表達水平;分離并培養(yǎng)小鼠原代骨髓基質中的干細胞,進行成骨和成脂誘導分化,檢測Kdm4a在成脂和成骨分化過程的表達差異。在骨髓基質干細胞系ST2和原代骨髓基質干細胞中升高或降低Kdm4a的表達水平,利用q RT-PCR、Western blotting檢測成骨和成脂相關基因在誘導后的表達變化,采用油紅O染色和堿性磷酸酶染色觀察KDM4A對細胞分化狀態(tài)的影響。構建Kdm4a酶活性突變質粒觀察喪失酶活性后KDM4A對細胞分化調控的改變。篩選KD... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

plvx-shRNA2質粒圖譜

大學博士學位論文 KDM4A 對骨髓基質干細胞定向分化的果dm4a 在小鼠不同組織中的相對表達取 6 周齡 C57BL/6J 小鼠各組織的 mRNA，采用 qRT-PCR 方法檢dm4a 的表達變化。結果如圖 1.2 所示，Kdm4a 在骨和骨骼肌中高、腎和腦中表達量適中，在肝、肺、脾、結腸、腹股溝脂肪、附肪和腎周脂肪中表達量較低。以 Kdm4a 表達量最低的小腸組織作骼肌的表達量是在小腸中表達量的 88.9、42.5 倍。

圖 1.3 Kdm4a 在小鼠原代骨髓基質干細胞成脂和成骨分化過程中的 mRNA 表達變化A 圖：Adipogenic 為成脂誘導，B 圖：Osteogenic 為成骨誘導* p<0.05 vs.誘導 0d。1.2.3 Kdm4a 過表達質粒和突變型質粒對 ST2 細胞成脂和成骨分化的影響1.2.3.1 Kdm4a 突變型質粒的構建根據(jù) NCBI 獲得 Kdm4a 的基因序列，找到酶活性位點，分別將肽鏈上第 133位，138 位，165 位和 170 位的 G 突變?yōu)?A，設計合成誘變引物。因為突變位點之間不連續(xù)，因此設計兩對突變引物（在每個待突變位點處設計部分反向互補的引物對，每對正反向引物 5’端包含 15-21bp 反向互補區(qū)域），以野生型 Kdm4a質粒作為模板進行 PCR 擴增。兩對突變引物分別擴增出兩個片段，DpnI 酶消化PCR 產(chǎn)物后切膠回收。兩個片段通過同源重組連接，轉化，提取質粒即為 Kdm4a突變型質粒（命名為 Kdm4a-Mut 質粒），經(jīng)生物公司鑒定正確，在菌液中加入凍

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Lysine-specific demethylase 1 inhibitor rescues the osteogenic ability of mesenchymal stem cells under osteoporotic conditions by modulating H3K4 methylation[J]. Longwei Lv,Wenshu Ge,Yunsong Liu,Guanyou Lai,Hao Liu,Wenyue Li,Yongsheng Zhou.  Bone Research. 2016(04)



本文編號：3558942