目的:探討經(jīng)Ⅰ型膠原酶消化法提取的SD大鼠原代脂肪干細(xì)胞（ADSCs）,誘導(dǎo)分化為雪旺樣細(xì)胞（d ADSCs）,比較ADSCs分化前后細(xì)胞形態(tài)、染色特性及細(xì)胞表面特征分子、嘌呤受體P2X7,髓鞘蛋白P0和神經(jīng)營養(yǎng)因子及相應(yīng)受體的表達(dá)變化,從而觀察ADSCs是否具有向雪旺細(xì)胞（SCs）的分化潛能并具有修復(fù)神經(jīng)損傷的必要的物質(zhì),為臨床ADSCs用于修復(fù)神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:雄性SD大鼠,體重300±10g,無菌條件下解剖取大鼠腹股溝處脂肪組織,經(jīng)Ⅰ型膠原酶消化后離心,200目細(xì)胞篩過濾,接種培養(yǎng)。通過差速貼壁法純化細(xì)胞,傳至第3代后開始用于實(shí)驗(yàn)。MTT法檢測第3代、第5代、第7代、第9代和第13代細(xì)胞活性。選用第3代ADSCs細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測ADSCs表面特征分子CD29,CD44,CD45和CD90,根據(jù)其陽性表達(dá)率鑒定ADSCs特性。u ADSCs以2×105/m L的密度鋪六孔板,用1m Mβ-巰基乙醇處理24 h,35 ng/m L全反式維甲酸處理72 h,5 ng/m LPDGF、10ng/m Lb FGF、14u Mforskolin、200ng/m L he... 

【文章來源】：蘭州大學(xué)甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

外周神經(jīng)損傷，雪旺細(xì)胞促軸突生長，形成髓鞘示意圖

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 脂肪干細(xì)胞的分離提取及誘導(dǎo)分化為雪旺樣細(xì)胞的特性研究第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 ADSCs 的形態(tài)特征本實(shí)驗(yàn)采用 SD 大鼠為研究對象，提取分離大鼠 ADSCs，Ⅰ型膠原酶消化法對大鼠脂肪組織消化，離心過濾后提取的原代 ADSCs 見圖 A，ADSCs 與許多雜細(xì)胞一起漂浮，均為圓形；24 h 細(xì)胞換半液后，多數(shù) ADSCs 已經(jīng)貼壁生長如圖B 所示：細(xì)胞為圓形，含有少許未貼壁的雜細(xì)胞，未貼壁的 ADSCs 和其他雜細(xì)胞減少；48 h 換液后見圖 C，細(xì)胞已經(jīng)全部貼壁，成短梭形、星型結(jié)構(gòu)及不規(guī)則多角形等結(jié)構(gòu)，成纖維狀，紡錘形或聚集成片狀。細(xì)胞開始快速增長，待長 5～7 d 后，細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶底后按照 1:2 比例傳代，第一代 ADSCs 見圖 D，ADSCs是長梭形，少部分多角形等結(jié)構(gòu)。

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 脂肪干細(xì)胞的分離提取及誘導(dǎo)分化為雪旺樣細(xì)胞的特性研究3.2 MTT 比色法測定 ADSCs 生長活力MTT 法測定 ADSCs 生長曲線呈 S 形 24h 后細(xì)胞進(jìn)入快速增長期，24 h-48 之間細(xì)胞生長緩慢，進(jìn)入平臺期。72 h 后細(xì)胞增殖并進(jìn)入對數(shù)生長期，在第 5 天時細(xì)胞生長達(dá)到峰值后，生長活性開始下降。此外，通過比較 P3、P5、P7、P和 P13 代的 ADSCs 生長活性的測定發(fā)現(xiàn) P3 細(xì)胞生長活性最強(qiáng)，而 P13 生長活性最差，說明傳代次數(shù)越多，細(xì)胞生長活力越低。復(fù)蘇后 P3 代細(xì)胞，MTT 檢測發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞生長增殖及形態(tài)特征方面和凍存前沒有區(qū)別，但是平臺期較長，在第 3 天進(jìn)入快速增長期，第 5 天細(xì)胞生長達(dá)到最大，隨后緩慢生長。ADSCs 形態(tài)穩(wěn)定，生長活性不因凍存而改變，可以穩(wěn)定遺傳。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Chronically denervated distal nerve stump inhibits peripheral nerve regeneration[J]. Giulia Ronchi,Stefania Raimondo.  Neural Regeneration Research. 2017(05)
[2]Current progress in use of adipose derived stem cells in peripheral nerve regeneration[J]. Shomari DL Zack-Williams,Peter E Butler,Deepak M Kalaskar.  World Journal of Stem Cells. 2015(01)
[3]Ursolic acid induces neural regeneration after sciatic nerve injury[J]. Biao Liu,Yan Liu,Guang Yang,Zemin Xu,Jiajun Chen.  Neural Regeneration Research. 2013(27)

博士論文
[1]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及對外周面神經(jīng)損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 李陽.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 2013



本文編號：3496396