本文關(guān)鍵詞：兩個新型結(jié)核桿菌DNA甲基化酶的鑒定和性質(zhì)初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：DNA甲基化是DNA表觀修飾的普遍形式,它幾乎存在于所有生命體中,包括細(xì)菌。DNA甲基化修飾主要是由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的,在腺嘌呤或胞嘧啶上轉(zhuǎn)移一個甲基的過程。在細(xì)菌中,DNA甲基化酶通常與同源的限制性內(nèi)切酶一起組成限制-修飾(R-M)系統(tǒng),對細(xì)菌起防御保護功能。同時在許多基因組中也發(fā)現(xiàn)了孤兒甲基化酶,它們對基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。本文通過應(yīng)用三代單分子實時測序(SMRT)技術(shù),對牛結(jié)核分枝桿菌無毒株卡介苗BCG進行測序分析,首次報道了BCG菌株單堿基分辨水平的DNA甲基化組,包含3種DNA甲基化motif位點,均為m6A修飾。這3種甲基化motif的甲基化程度有所差異,其中CACGCAG和CTCCAG的甲基化程度達(dá)到99%以上,但GATN4RTAC的甲基化比例僅為77%,而且該motif與其他兩種motif相比較,傾向于分布在基因間區(qū)及啟動子區(qū)。除了已報道的MamA DNA甲基化酶,本文又驗證了2個新型的DNA甲基化酶,分別是HsdM甲基化酶和MamB甲基化酶。我們通過重組表達(dá)、蛋白純化、基因敲除、重組質(zhì)粒酶切及三代測序等體外實驗技術(shù)對這兩個新型DNA甲基化酶進行了性質(zhì)研究。結(jié)果表明：1) HsdM是典型的Ⅰ型DNA甲基化酶,其甲基化位點是GATN4RTAC對第二個A進行m6A修飾,產(chǎn)生雙鏈甲基化。敲除突變體的實驗表明,HsdS2亞基是HsdM DNA甲基化酶的必需亞基,而HsdS1亞基是非必需的；2) MamB是一個ⅡG型融合DNA甲基化酶,其識別位點是CACGCAG,對第6個A進行m6A修飾,產(chǎn)生單鏈甲基化。本研究首次對結(jié)核桿菌復(fù)合群代表性菌株——BCG的DNA甲基化組及其DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶進行了深入分析,為結(jié)核病表觀修飾的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：DNA甲基化 單分子實時測序技術(shù) DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 專業(yè)詞匯中英文對照表9-13
• 第1章 引言13-29
• 1.1 結(jié)核桿菌的研究概況13-14
• 1.2 DNA甲基化修飾14-17
• 1.3 原核生物中甲基化轉(zhuǎn)移酶的概況17-18
• 1.4 細(xì)菌中的R-M系統(tǒng)18-23
• 1.5 結(jié)核甲基化研究進展23-24
• 1.6 DNA甲基化修飾的檢測方法24-27
• 1.6.1 重亞硫酸鹽測序法24
• 1.6.2 聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內(nèi)切酶分析法24-25
• 1.6.3 焦磷酸測序25
• 1.6.4 芯片技術(shù)25
• 1.6.5 熒光定量法25
• 1.6.6 質(zhì)譜檢測技術(shù)25
• 1.6.7 三代單分子實時測序(SMRT)技術(shù)25-27
• 1.7 本課題的研究目的及意義27-29
• 第2章 實驗材料和方法29-47
• 2.1 實驗材料29-32
• 2.1.1 實驗菌株29
• 2.1.2 質(zhì)粒29
• 2.1.3 工具酶29-30
• 2.1.4 試劑(盒)及配制30-31
• 2.1.5 溶菌酶溶液的配制31
• 2.1.6 LB培養(yǎng)基的配制31
• 2.1.7 結(jié)核菌培養(yǎng)基的配制31
• 2.1.8 SDS-PAGE凝膠配制31-32
• 2.2 引物序列32-33
• 2.3 儀器與耗材33-34
• 2.4 實驗方法34-47
• 2.4.1 牛結(jié)核桿菌卡介苗BCG的培養(yǎng)34
• 2.4.2 BCG基因組DNA提取34
• 2.4.3 三代單分子實時測序(SMRT)技術(shù)34
• 2.4.4 三代測序數(shù)據(jù)分析34-35
• 2.4.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備35
• 2.4.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化35-36
• 2.4.7 DNA膠回收實驗36
• 2.4.8 HsdM甲基化酶識別位點的鑒定36-39
• 2.4.9 通過HsdM敲除突變體鑒定甲基化酶亞基的活性39-41
• 2.4.10 MamB甲基化酶識別位點的鑒定41-43
• 2.4.11 MamB甲基化酶的內(nèi)切酶功能鑒定43-47
• 第3章 三代單分子實時測序(SMRT)技術(shù)檢測卡介苗BCG甲基化組47-53
• 3.1 背景介紹47-48
• 3.2 實驗結(jié)果和分析48-51
• 3.2.1 基因組拼接與注釋48-49
• 3.2.2 DNA甲基化的分布49-50
• 3.2.3 DNA甲基化酶的預(yù)測50-51
• 3.3 小結(jié)及討論51-53
• 第4章 DNA甲基化酶HsdM的鑒定及性質(zhì)研究53-65
• 4.1 背景介紹53
• 4.2 實驗結(jié)果和分析53-61
• 4.2.1 實驗設(shè)計思路54-55
• 4.2.2 Ⅰ型HsdM甲基化轉(zhuǎn)移酶識別motif的鑒定55-57
• 4.2.3 敲除突變體S2MS1的DNA甲基化酶活性鑒定57-58
• 4.2.4 敲除突變體S2M的DNA甲基化酶活性鑒定58-60
• 4.2.5 敲除突變體MS1的DNA甲基化酶活性鑒定60-61
• 4.3 小結(jié)和討論61-65
• 第5章 DNA甲基化酶MamB的鑒定及性質(zhì)研究65-71
• 5.1 背景介紹65
• 5.2 實驗結(jié)果和分析65-70
• 5.2.1 MamB甲基化轉(zhuǎn)移酶識別motif的鑒定65-68
• 5.2.2 MamB蛋白的表達(dá)與純化68-70
• 5.3 小結(jié)和討論70-71
• 第6章 總結(jié)與展望71-73
• 參考文獻(xiàn)73-83
• 附錄 DNA甲基化酶核苷酸序列83-91
• 個人簡歷91

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  本文關(guān)鍵詞：兩個新型結(jié)核桿菌DNA甲基化酶的鑒定和性質(zhì)初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：346018