發(fā)布時(shí)間：2017-05-04 00:07

  本文關(guān)鍵詞：衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)毒力基因的體外鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化沙眼衣原體鼠肺炎株(MoPn)。比較幾種轉(zhuǎn)化MoPn菌株在體外培養(yǎng)中對宿主細(xì)胞的感染力,鑒定與衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的毒力基因,并比較不同實(shí)驗(yàn)條件對衣原體侵襲和粘附宿主細(xì)胞能力的影響;鑒定影響衣原體在宿主細(xì)胞與細(xì)胞間傳播和生長能力和導(dǎo)致包涵體內(nèi)糖原合成障礙相關(guān)的基因。方法:選取Hela細(xì)胞為宿主細(xì)胞,將攜帶敲除了衣原體質(zhì)粒中不同開放閱讀框(ORF)的各轉(zhuǎn)化菌株接種培養(yǎng)20~24h,復(fù)蘇成功后不斷擴(kuò)增收集。采用泛影鈉-泛影葡胺密度梯度離心法進(jìn)行菌株的純化;測定各菌株濃度,按相同的菌量接種,設(shè)定離心+二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-D)、離心、DEAE-D、無任何處理四個(gè)接種條件,在不同的實(shí)驗(yàn)條件下分別對各菌株進(jìn)行處理,利用間接免疫熒光顯微鏡計(jì)數(shù)包涵體數(shù)目;分別于(20、40、60 h)觀察各菌株連續(xù)3代感染細(xì)胞后菌斑形成的速度與面積大小;采用Lugol碘液染色,在倒置顯微鏡下,觀察各菌株包涵體內(nèi)糖原的合成情況。結(jié)果:純化后獲得了高感染活性的沙眼衣原體原體(EB)。敲除質(zhì)粒編碼蛋白Pgp4的菌株p GFP::CMΔPgp4在4種條件下包涵體數(shù)目分別為(10.20±1.30)、(6.80±0.44)、(3.00±1.22)和(0.80±0.45)個(gè),陰性對照組質(zhì)粒缺失株CMUT3包涵體數(shù)目分別為(6.40±0.89)、(3.80±0.83)、(1.60±0.89)和(0.60±0.54)個(gè),同一條件下兩者均表現(xiàn)出相近的感染能力,包涵體數(shù)目均低于同一條件下其他菌株(均P0.01);同一菌株在不同條件下,包涵體數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=845.310,P0.01);各菌株在離心+DEAE-D條件下包涵體數(shù)目最多;菌株p GFP::CMΔPgp4和質(zhì)粒缺失株連續(xù)3代感染細(xì)胞時(shí)菌斑形成的速度和面積大小均低于其他菌株;并出現(xiàn)糖原累積的障礙。結(jié)論:超速低溫密度梯度離心純化能夠去除細(xì)胞中其它細(xì)胞成分對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,較既往常規(guī)的純化方法更能保證結(jié)果的可靠性。Pgp4是衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的毒力基因之一,影響衣原體在宿主細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播和生長能力和包涵體內(nèi)糖原的合成能力。實(shí)驗(yàn)條件離心和DEAE-D均能增強(qiáng)毒力基因在體外對宿主細(xì)胞的侵襲和粘附能力。
【關(guān)鍵詞】：沙眼衣原體 純化 質(zhì)粒 開放閱讀框 毒力基因
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R374
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 縮略語/符號說明9-10
• 前言10-15
• 研究現(xiàn)狀、成果10-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、沙眼衣原體鼠肺炎株擴(kuò)增與純化方法的建立15-29
• 1.1 對象和方法15-22
• 1.1.1 材料15-17
• 1.1.2 方法17-22
• 1.2 結(jié)果22-25
• 1.2.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 1.2.2 C.t間接免疫熒光檢測復(fù)蘇結(jié)果23-24
• 1.2.3 間接免疫熒光檢測純化結(jié)果24-25
• 1.3 討論25-28
• 1.3.1 沙眼衣原體鼠肺炎株培養(yǎng)用單層細(xì)胞制備25-26
• 1.3.2 沙眼衣原體鼠肺炎株的檢測26
• 1.3.3 體外純化實(shí)驗(yàn)討論26-28
• 1.4 小結(jié)28-29
• 二、體外鑒定與衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的毒力基因29-39
• 2.1 材料和方法29-31
• 2.1.1 材料29
• 2.1.2 方法29-31
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31
• 2.2 結(jié)果31-35
• 2.2.1 各菌株濃度測定的結(jié)果31-32
• 2.2.2 體外檢測各菌株感染能力32-33
• 2.2.3 各菌株菌斑形成能力檢測33-34
• 2.2.4 各菌株糖原合成能力檢測碘染色34-35
• 2.3 討論35-38
• 2.3.1 沙眼衣原體體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論35-37
• 2.3.2 沙眼衣原體體外實(shí)驗(yàn)意義37-38
• 2.4 小結(jié)38-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-47
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明47-48
• 綜述 沙眼衣原體質(zhì)粒研究進(jìn)展48-62
• 綜述參考文獻(xiàn)55-62
• 致謝62

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李保安;范久波;劉海菊;劉開琴;程瑾;李智山;;金標(biāo)數(shù)碼定量閱讀儀QPAD的性能驗(yàn)證[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年02期

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王則宇;α-甘露糖苷酶活性在沙眼衣原體侵染細(xì)胞中的作用及其診斷價(jià)值的研究[D];鄭州大學(xué);2014年

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 肖萌;泌尿生殖道沙眼衣原體感染者血清抗衣原體免疫優(yōu)勢蛋白抗體的檢測[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)毒力基因的體外鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：344018