發(fā)布時(shí)間：2017-05-03 20:12

  本文關(guān)鍵詞：超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文對(duì)從胃腸道患者糞便中分離得到的副溶血性弧菌C4株進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行多輪的超高壓處理獲得具有耐壓遺傳特性的耐壓株N11。通過溶血實(shí)驗(yàn)、生物被膜形成能力和小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠臟器損傷程度,來比較原始株C4和耐壓株N11的體內(nèi)毒力和體外毒力。以原始株C4和耐壓株N11的全基因組DNA為模板,構(gòu)建C4株的Paired-end library、Mate-pair library文庫(kù)和N11株的Paired-end library文庫(kù),進(jìn)而采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)C4株的全基因組序列進(jìn)行拼接、注釋、預(yù)測(cè)和COG分類,結(jié)合N11株的全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行兩者間的比較基因組分析,以篩選N11株內(nèi)發(fā)生的突變堿基。最后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)考察受突變位點(diǎn)調(diào)控的基因和毒力相關(guān)基因在C4和N11這兩株菌之間的差異表達(dá),以分析超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機(jī)理,為食品安全以及細(xì)菌毒性變化提供生物學(xué)依據(jù)。具體結(jié)論如下：對(duì)從胃腸道患者糞便中分離得到的菌株進(jìn)行生化和基因型的鑒定,確定該菌株為副溶血性弧菌,并命名為C4株。以C4株為研究對(duì)象,經(jīng)過多輪超高壓馴化,得到耐壓株N11。溶血實(shí)驗(yàn)表明C4和N11這兩株菌均有微弱的溶血現(xiàn)象,但是無法比較它們的毒力大小。生物被膜形成能力結(jié)果顯示,C4株的形成能力顯著高于N11株。小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)表明,N11株的半數(shù)致死劑量(LDso)高于C4株；而進(jìn)一步的小鼠臟器病理學(xué)分析結(jié)果亦顯示N11株對(duì)小鼠臟器的損傷程度較低,即超高壓處理減弱了副溶血性弧菌的毒力。對(duì)高通量測(cè)序得到的C4株reads進(jìn)行組裝和拼接,最終得到含有12個(gè)scaffolds的全基因組序列,其中CDS、tRNA、rRNA的數(shù)量分別為4850、110、11個(gè)�；谌蚪M蛋白質(zhì)序列所構(gòu)建的進(jìn)化樹表明,C4株與副溶血性弧菌的親緣關(guān)系最近,這進(jìn)一步證實(shí)C4株為副溶血性弧菌,以及基因預(yù)測(cè)的結(jié)果也較為理想。COG分類發(fā)現(xiàn)C4株內(nèi)有38%的基因參與了細(xì)菌的代謝過程；差異位點(diǎn)分析表明,N11株相對(duì)于C4株有4個(gè)區(qū)域共21個(gè)核苷酸發(fā)生了突變。對(duì)C4株全基因組序列上的毒力相關(guān)基因進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)C4株中存在編碼TDH-S、TDH-A、TLH的基因,但未發(fā)現(xiàn)編碼TRH的基因；存在兩組編碼Ⅳ型菌毛(Type Ⅳ pili,TFP)的基因,分別為角質(zhì)菌毛(Chitin-regulated pilus,ChiRP)以及甘露醇敏感凝血素IV型菌毛(mannose-sensitive hemagglutinin,MSHA);存在兩個(gè)ⅢI型分泌系統(tǒng),分別為TTSS1和TTSS2;未發(fā)現(xiàn)編碼尿素酶的基因。以培養(yǎng)中的C4和N11株的mRNA為模板,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析毒力基因的相對(duì)表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)編碼主要溶血毒素和MSHA的基因在N11株中的表達(dá)量顯著低于C4株,溶血毒素是副溶血性弧菌中的主要毒力因子,N11株表達(dá)量的減少可能是其毒力降低的主要原因。此外,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了受突變位點(diǎn)調(diào)控的上下游基因：C4_4795基因編碼生成RNA結(jié)合蛋白,發(fā)現(xiàn)該基因的mRNA表達(dá)水平發(fā)生下調(diào),推測(cè)這可能會(huì)導(dǎo)致N11株毒力的降低；C4 4609基因可翻譯成HD-GYP結(jié)構(gòu)域,在N11株中該基因的mRNA表達(dá)水平下調(diào),有可能削弱對(duì)環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)的降解作用,進(jìn)而減弱了N11株的運(yùn)動(dòng)性和毒力因子的產(chǎn)生,從而降低了耐壓株N11的毒力。
【關(guān)鍵詞】：副溶血性弧菌 超高壓處理 耐壓 毒力變化
【學(xué)位授予單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 第1章 前言13-23
• 1.1 細(xì)菌的致病性及其影響因素13-15
• 1.1.1 細(xì)菌的致病性13
• 1.1.2 細(xì)菌致病性的影響因素13-15
• 1.1.2.1 侵襲力13-14
• 1.1.2.2 細(xì)菌毒素14
• 1.1.2.3 細(xì)菌侵入的數(shù)量14
• 1.1.2.4 細(xì)菌侵入機(jī)體的途徑14-15
• 1.2 副溶血性弧菌的生物學(xué)特性及其主要毒力因子15-19
• 1.2.1 生物學(xué)特性15-16
• 1.2.2 副溶血弧菌的主要毒力因子16-19
• 1.2.2.1 溶血毒素16-17
• 1.2.2.2 粘附因子17-18
• 1.2.2.3 胞外蛋白酶18
• 1.2.2.4 尿素酶(Ure)18
• 1.2.2.5 Ⅲ型分泌系統(tǒng)18-19
• 1.2.2.6 其他毒力因子19
• 1.3 堿基突變對(duì)生物性狀的影響19-21
• 1.3.1 堿基突變的誘因19-20
• 1.3.2 堿基突變對(duì)生物個(gè)體的影響20-21
• 1.4 技術(shù)路線、研究?jī)?nèi)容及意義21-23
• 1.4.1 技術(shù)路線21
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容21-22
• 1.4.2.1 菌株鑒定、篩選及毒力評(píng)價(jià)21
• 1.4.2.2 基因組測(cè)序、分析及差異位點(diǎn)分析21-22
• 1.4.2.3 全基因組中毒力基因分析及其與突變位點(diǎn)相關(guān)基因的差異表達(dá)分析22
• 1.4.3 研究意義22-23
• 第2章 菌株鑒定、篩選及毒力評(píng)價(jià)23-41
• 2.1 引言23
• 2.2 材料與儀器23-24
• 2.2.1 菌種與材料23-24
• 2.2.2 儀器與設(shè)備24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 2.3.1 菌株的分離與培養(yǎng)24-25
• 2.3.2 生化鑒定25
• 2.3.3 細(xì)菌總DNA的提取及PCR驗(yàn)證25-26
• 2.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及在線比對(duì)26
• 2.3.5 生長(zhǎng)曲線的繪制26-27
• 2.3.6 耐壓菌株的篩選27
• 2.3.7 菌株體外毒力測(cè)定27-28
• 2.3.7.1 溶血性測(cè)定27
• 2.3.7.2 生物被膜形成能力測(cè)定27-28
• 2.3.8 菌株體內(nèi)毒力測(cè)定28-30
• 2.3.8.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.3.8.2 小鼠肝臟與脾臟組織切片和HE染色29-30
• 2.4 結(jié)果與討論30-39
• 2.4.1 生化鑒定結(jié)果30-31
• 2.4.2 基因型鑒定結(jié)果31-34
• 2.4.3 耐壓菌株的篩選結(jié)果及菌株的生長(zhǎng)曲線34-35
• 2.4.4 菌株體外毒力測(cè)定結(jié)果35-36
• 2.4.4.1 溶血性測(cè)定結(jié)果35-36
• 2.4.4.2 生物被膜形成能力的比較36
• 2.4.5 菌株體內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果36-39
• 2.4.5.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.4.5.2 病理組織學(xué)變化37-39
• 2.5 本章小結(jié)39-41
• 第3章 基因組測(cè)序及分析41-56
• 3.1 引言41
• 3.2 材料與儀器41-42
• 3.2.1 菌株與材料41
• 3.2.2 儀器與設(shè)備41-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-45
• 3.3.1 基因組DNA的提取及檢測(cè)42
• 3.3.2 基因組測(cè)序和預(yù)處理42
• 3.3.3 基因組拼接、預(yù)測(cè)和注釋42-43
• 3.3.4 構(gòu)建全基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹43-44
• 3.3.5 COG分類44
• 3.3.6 兩株菌全基因組差異位點(diǎn)分析44-45
• 3.4 結(jié)果與討論45-55
• 3.4.1 DNA樣品質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果45-46
• 3.4.2 reads質(zhì)量滿足基因組分析46-48
• 3.4.3 基因組拼接結(jié)果和預(yù)測(cè)48-50
• 3.4.4 C4菌株的進(jìn)化分析50-51
• 3.4.5 基因的COG分類51-53
• 3.4.6 非編碼區(qū)基因位點(diǎn)發(fā)生突變53-55
• 3.5 本章總結(jié)55-56
• 第4章 毒力基因及突變位點(diǎn)相關(guān)基因的差異表達(dá)分析56-68
• 4.1 引言56
• 4.2 材料與儀器56-57
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料56-57
• 4.2.2 儀器與設(shè)備57
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法57-60
• 4.3.1 基因組中毒力相關(guān)基因分析57
• 4.3.2 全基因組RNA的提取57
• 4.3.3 RNA中基因組DNA的去除57-58
• 4.3.4 cDNA的合成58
• 4.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR58-60
• 4.4 結(jié)果與討論60-67
• 4.4.1 菌株中毒力相關(guān)基因的分布60-64
• 4.4.2 主要毒力因子的差異表達(dá)64-65
• 4.4.3 突變位點(diǎn)鄰近基因的差異表達(dá)65-67
• 4.5 本章總結(jié)67-68
• 第5章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望68-71
• 5.1 結(jié)論68-69
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)69
• 5.3 展望69-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 碩士期間發(fā)表的論文77-78
• 致謝78-79

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李志峰,戴迎春;副溶血弧菌的溶血毒素研究現(xiàn)況[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

  本文關(guān)鍵詞：超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：343673