本文關(guān)鍵詞：輪狀病毒VP4抗原表位在VP6載體蛋白同一位點(diǎn)表達(dá)比較研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：輪狀病毒(RV)能夠引起人類、哺乳動(dòng)物類、禽類腹瀉,其中A組RV是引起嬰幼兒急性胃腸炎的主要病原體。完整的RV共有三層衣殼,其基因組包裹在同心衣殼蛋白組成的二十面體顆粒中,由11個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA組成。RVVP6蛋白位于病毒的中間層衣殼,既是病毒含量中最豐富的蛋白,也是RV的組抗原蛋白。VP6蛋白氨基酸序列具有高度保守性,并具有較強(qiáng)的抗原交叉反應(yīng)性：RV VP4和VP7是主要的中和抗體原蛋白。VP4蛋白在病毒外殼形成刺突樣結(jié)構(gòu),能獨(dú)立誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。目前上市的RV疫苗均為減毒活疫苗,這些疫苗雖有其優(yōu)勢(shì),也有一定潛在的不足,開發(fā)安全有效的新型疫苗仍具有重要意義。本研究選取VP4蛋白上具有高度保守性和抗原交叉反應(yīng)性的第296-313位和第381-401位氨基酸抗原表位進(jìn)行重組抗原表位嵌合蛋白研究。采用基因工程技術(shù),成功構(gòu)建A組人RV TB-Chen株VP6載體蛋白,將上述兩個(gè)抗原表位分別插入VP6蛋白載體基因同一位點(diǎn),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中成功表達(dá)出兩個(gè)在VP6載體蛋白表面攜帶有VP4中和抗原表位的重組嵌合蛋白。表達(dá)的嵌合蛋白可與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；可誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生特異性血清抗體；抗嵌合蛋白血清抗體可特異性識(shí)別載體蛋白VP6F, Wa株病毒的VP6和VP4蛋白,可中和Wa株病毒在MA104細(xì)胞上的感染性。結(jié)果表明,所構(gòu)建和表達(dá)的兩個(gè)以VP6為載體的VP4抗原表位嵌合蛋白具有較高抗原反應(yīng)性和免疫原性；嵌合蛋白攜帶的VP4抗原表位具有增強(qiáng)載體蛋白免疫原性作用。本研究為研制新型RV重組蛋白疫苗的奠定較好基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：輪狀病毒 VP4抗原表位 VP6蛋白載體 重組嵌合蛋白 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-8
• 前言8-14
• 實(shí)驗(yàn)材料和方法14-31
• 一、實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 1. 主要儀器14-15
• 2. 主要試劑15
• 3. 菌毒株,載體質(zhì)粒,細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15-16
• 二.實(shí)驗(yàn)方法16-31
• 1. 構(gòu)建pETP6重組質(zhì)粒并鑒定16-21
• 1.1 合成引物16-17
• 1.2 TB-Chen株RV VP6全編碼基因組的PCR擴(kuò)增17
• 1.3 回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物17
• 1.4 制備連接片段并進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化17-19
• 1.4.1 連接片段的制備17-18
• 1.4.2 VP6基因與pETL載體酶切片斷連接18
• 1.4.3 連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞18-19
• 1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pETP6的制備及鑒定19-21
• 1.5.1 堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA19
• 1.5.2 Nde Ⅰ/BamH Ⅰ酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒19
• 1.5.3 大量制備質(zhì)粒DNA19-20
• 1.5.4 核苷酸序列測(cè)定20-21
• 2 pETP6v載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定21-24
• 2.1 攜帶Sac Ⅱ酶切位點(diǎn)的載體質(zhì)粒制備及鑒定21-24
• 2.1.1 攜帶Sac Ⅱ酶切位點(diǎn)的插入片段的制備21-22
• 2.1.2 載體片段制備22
• 2.1.3 插入片段與載體質(zhì)粒酶切片段的連接22-23
• 2.1.4 連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌細(xì)胞23
• 2.1.5 堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA23
• 2.1.6 酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pETP6v(Sac Ⅱ)23
• 2.1.7 大量制備質(zhì)粒DNA23
• 2.1.8 核苷酸序列測(cè)定23-24
• 3. 含有VP6蛋白基因不同位置上帶有不同酶切位點(diǎn)的pETP6v載體質(zhì)粒的構(gòu)建24
• 4. 攜帶RV VP4抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒pETP6F298S/P[8]296和pETP6F298S/P[8]381的構(gòu)建及鑒定24-26
• 4.1 外源抗原表位(P[8]296,P[8]381)的設(shè)計(jì)24-25
• 4.2 引物互補(bǔ)片段的制備25
• 4.3 載體質(zhì)粒pETP6F酶切片段的制備25
• 4.4 插入片段和載體質(zhì)粒pETP6v酶切片段的連接及轉(zhuǎn)化25-26
• 4.5 連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌細(xì)胞26
• 4.6 堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA26
• 4.7 酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒26
• 4.8 大量制備質(zhì)粒DNA26
• 4.9 核苷酸序列測(cè)定26
• 5. 重組VP6F載體蛋白和重組嵌合蛋白6F/P[8]296,6F/P[8]381在大腸桿菌中的表達(dá)26-27
• 6. 重組載體蛋白(rVP6v)和重組嵌合蛋白的純化27
• 7. Bradford法測(cè)定純化蛋白的濃度27-28
• 8. MA104細(xì)胞復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)28
• 8.1 MA104細(xì)胞的復(fù)蘇28
• 8.2 MA104細(xì)胞的傳代培養(yǎng)28
• 9. RV增殖,收獲28-29
• 10. RV的純化29
• 11. 動(dòng)物免疫及血清抗體的制備29-30
• 11.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組29
• 11.2 免疫方案29-30
• 12. 微量滴定法測(cè)Wa病毒感染性滴度30
• 13. 重組VP6F載體蛋白和重組嵌合蛋白pETP6F298S/P[8]/296和pETP6F298S/P[8]/381免疫豚鼠血清中和抗體效價(jià)的檢測(cè)30
• 14. Western blot檢測(cè)純化的重組嵌合蛋白的免疫原性30-31
• 結(jié)果與分析31-38
• 1 質(zhì)粒的構(gòu)建31-33
• 1.1 VP6基因的擴(kuò)增31-32
• 1.2 攜帶RV VP6基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pETP6的構(gòu)建及鑒定32
• 1.3 攜帶外源抗原表位的重組表達(dá)質(zhì)粒pETP6F298S/P[8]/296和pETP6F298S/P[8]/381的構(gòu)建及鑒定32-33
• 2 重組嵌合蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)和純化33-34
• 3 純化蛋白濃度的測(cè)定34-35
• 4 RV病毒感染性滴度的測(cè)定和免疫動(dòng)物血清中和抗體滴度測(cè)定35-36
• 5 Western blot分析36-38
• 討論38-41
• 小結(jié)41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 附錄46-65
• (一) 縮略詞46-47
• (二) 主要溶液配方47-55
• (三) 主要實(shí)驗(yàn)步驟55-63
• (四) RVTB-CHEN株VP6編碼基因核苷酸序列及氨基酸序列63-65
• 致謝65-66
• 研究生簡(jiǎn)歷66-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 湯晶晶;韓新民;;小兒輪狀病毒腸炎研究進(jìn)展[J];遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2013年04期

2 張艷;文喻玲;魏海濤;李傳印;范耀春;陳元鼎;;A組輪狀病毒VP5~*和VP8~*的表達(dá)和免疫學(xué)性質(zhì)研究(英文)[J];中國(guó)生物工程雜志;2010年02期

3 潘小霞;張順;陳元鼎;;輪狀病毒VP_6蛋白免疫學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)疫苗和免疫;2011年02期

  本文關(guān)鍵詞：輪狀病毒VP4抗原表位在VP6載體蛋白同一位點(diǎn)表達(dá)比較研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：344284