本文關(guān)鍵詞：鼠疫菌和志賀菌毒力大質(zhì)粒對細菌蛋白表達譜的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：志賀氏菌(Shigella),又稱痢疾桿菌,是一類無鞭毛,不形成芽孢的革蘭氏陰性桿菌,為人類細菌性痢疾的主要病原體。鼠疫耶爾森氏菌是一類有莢膜,無鞭毛,不形成芽孢的革蘭氏陰性短桿菌,是鼠疫的病原菌。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是某些革蘭氏陰性病原菌所具有的一種特殊細胞結(jié)構(gòu),志賀氏菌和鼠疫耶爾森氏菌都具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)跨越病原細菌的內(nèi)膜、外膜及宿主細胞膜。細菌內(nèi)合成的蛋白質(zhì)通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)分泌到宿主細胞中,這些蛋白在病原菌侵襲宿主以及宿主致病過程中發(fā)揮重要作用。在這兩種細菌中,Ⅲ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成蛋白及效應(yīng)分子,均由一類進化過程中外源獲得的毒力大質(zhì)粒編碼。為了更好地研究外源毒力大質(zhì)粒對細菌蛋白表達譜的影響及其共性和特性,本文擬對兩種不同的病原菌進行對比分析。眾所周知,細胞內(nèi)的大多數(shù)蛋白通常要和其它蛋白相互結(jié)合并相互調(diào)節(jié),最終形成蛋白復(fù)合物來行使其功能。非變性凝膠電泳(BN-PAGE),在分離蛋白質(zhì)復(fù)合物的時候,能夠保持蛋白的生物學(xué)活性。在蛋白復(fù)合物分離以及蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用等多個領(lǐng)域研究發(fā)揮了重要作用。本研究首先采用BN-PAGE方法從毒力編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)質(zhì)粒缺失突變株和野生株的全菌復(fù)合物蛋白及膜復(fù)合物蛋白的對比中,發(fā)現(xiàn)志賀氏菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力質(zhì)粒缺失與谷氨酸脫羧酶及ATP合成酶的復(fù)合物形成有關(guān),而在鼠疫耶爾森氏菌中,并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。隨后,我們希望從蛋白質(zhì)組水平分析鼠疫菌毒力大質(zhì)粒對細菌表達譜的影響,并與福氏志賀氏菌中的類似研究進行對比,以期闡明兩種細菌在毒力質(zhì)粒表達調(diào)控中的異同。本研究通過雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜分析相結(jié)合的方法,比較了鼠疫缺失編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)的質(zhì)粒缺失菌株和野生株在26℃和37℃培養(yǎng)條件下的蛋白表達差異,成功分離并鑒定了鼠疫耶爾森氏菌野生株和毒力大質(zhì)粒缺失突變株中的差異蛋白,其中26℃條件下鑒定到29個差異蛋白,37℃條件下鑒定到25個差異蛋白,其中包含7個由pCD1質(zhì)粒編碼的蛋白。但沒有檢測到與谷氨酸脫羧酶及ATP合成酶有關(guān)的蛋白表達變化。這些差異蛋白中僅有2個與志賀氏菌中的報道相符,說明兩種細菌的基因調(diào)控模式存在顯著差異。此外,針對前期研究發(fā)現(xiàn)的表達量受毒力大質(zhì)粒調(diào)控的志賀氏菌谷氨酸脫羧酶,我們構(gòu)建了相應(yīng)的基因突變株并對其編碼基因的調(diào)控進行了初步研究。由于谷氨酸脫羧酶存在兩種同工酶,我們利用λ-Red重組系統(tǒng)分別構(gòu)建了單缺失及雙缺失基因突變株,為進一步研究同工酶的功能奠定了基礎(chǔ)。同時利用磁珠捕獲及質(zhì)譜鑒定的方法,對谷氨酸脫羧酶可能的調(diào)控蛋白進行了初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除已報道的調(diào)控蛋白H-NS外,StpA、RuvA也可能參與了谷氨酸脫羧酶的調(diào)控。綜上所述,志賀氏菌和鼠疫耶爾森氏菌都具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu),Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)在腸道和呼吸道致病菌中都是重要的毒力因子,本研究采用的缺失株和野生株的復(fù)合物和蛋白質(zhì)組學(xué)研究,為毒力相關(guān)蛋白的篩選和蛋白功能研究提供了參考,也為今后開展蛋白質(zhì)復(fù)合物研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鼠疫耶爾森氏菌 志賀氏菌 蛋白復(fù)合物 Ⅲ型分泌系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 文獻綜述10-16
• 1 病原微生物簡介10
• 2 志賀氏菌簡介10-12
• 2.1 志賀氏菌流行病學(xué)10
• 2.2 志賀氏菌的致病途徑及機制10-11
• 2.3 志賀氏菌的抗酸機制11-12
• 2.4 志賀氏菌的毒力大質(zhì)粒和Ⅲ型分泌系統(tǒng)12
• 3 鼠疫耶爾森氏菌簡介12-14
• 3.1 鼠疫耶爾森氏菌的流行病學(xué)13
• 3.2 鼠疫耶爾森氏菌的致病途徑及機制13
• 3.3 鼠疫耶爾森氏菌的pCD1質(zhì)粒和Ⅲ型分泌系統(tǒng)13-14
• 4 BN-PAGE的簡介14-15
• 5 本研究的目的與意義15-16
• 第一章 病原菌蛋白復(fù)合物研究16-24
• 1 材料及試劑耗材16-17
• 1.1 菌株16-17
• 1.2 儀器和試劑17
• 1.3 實驗用溶液配制17
• 2 實驗方法17-19
• 2.1 志賀氏菌全菌復(fù)合物蛋白樣品制備17
• 2.2 志賀氏菌膜復(fù)合物蛋白樣品制備17-18
• 2.3 BN-PAGE各成分膠的配制18
• 2.4 BN-PAGE分離復(fù)合物18
• 2.5 Western blot18-19
• 3 實驗結(jié)果19-21
• 3.1 與ATP合成酶有關(guān)的復(fù)合物結(jié)果19-20
• 3.2 與IpaB毒力有關(guān)的復(fù)合物結(jié)果20
• 3.3 與谷氨酸脫羧酶GadB有關(guān)的復(fù)合物結(jié)果20-21
• 3.4 鼠疫耶爾森氏菌的復(fù)合物結(jié)果21
• 4 討論與分析21-24
• 第二章 鼠疫菌201野生株和201△pCD1缺失突變株蛋白表達譜的比較研究24-35
• 1 材料與儀器試劑24
• 1.1 菌株24
• 1.2 主要化學(xué)試劑耗材和儀器24
• 1.3 常用溶液的配制24
• 2 實驗方法24-26
• 2.1 雙向電泳24-26
• 2.1.1 菌株培養(yǎng)24
• 2.1.2 全菌蛋白樣品制備24-25
• 2.1.3 蛋白質(zhì)樣品純化25
• 2.1.4 上樣前處理純化樣品和水化25
• 2.1.5 等電聚焦25
• 2.1.6 膠條的平衡25-26
• 2.1.7 二向電泳26
• 2.1.8 染色及脫色26
• 2.1.9 圖像掃描26
• 2.1.10 膠內(nèi)酶切26
• 2.1.11 蛋白差異點的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測26
• 2.1.12 數(shù)據(jù)庫查詢26
• 3 實驗結(jié)果26-33
• 3.1 野生株與突變株雙向電泳圖譜27-28
• 3.2 201野生株與201△pCD1突變株差異蛋白質(zhì)譜結(jié)果鑒定28-33
• 3.2.1 在26℃培養(yǎng)條件下201野生株和201△pCD1缺失突變株差異表達蛋白28-30
• 3.2.2 在37℃培養(yǎng)條件下201野生株和201△pCD1缺失突變株差異表達蛋白30-32
• 3.2.3 質(zhì)粒編碼的鼠疫毒力相關(guān)蛋白32-33
• 4 討論33-35
• 第三章 301△gadA及301△gadA：：gadB缺失突變株構(gòu)建及谷氨酸脫羧酶功能研究35-43
• 1 材料與儀器試劑35
• 1.1 菌株和載體35
• 1.2 儀器和試劑35
• 1.3 實驗用的溶液配制35
• 2 實驗方法35-39
• 2.1 301△gadA及301△gadA：：gadB缺失突變株構(gòu)建35-38
• 2.1.1 引物設(shè)計35-36
• 2.1.2 線性打靶片段的構(gòu)建36-37
• 2.1.3 301/pKOBEG和301△gadB/pKOBEG菌株的構(gòu)建37
• 2.1.4 301 △gadA：：kan和301 AgadA-gadB：：kan突變株的構(gòu)建37-38
• 2.1.5 抗性基因的去除38
• 2.2 301△gadA、301△gadB及301△gadA：：gadB缺失突變株雙向電泳38
• 2.3 2457T野生株和2457T△hns突變株的磁珠捕獲實驗38-39
• 2.3.1 調(diào)控區(qū)DNA的獲得38
• 2.3.2 調(diào)控區(qū)DNA與磁珠相互作用38-39
• 2.3.3 磁珠捕獲相互作用蛋白39
• 2.3.4 相互作用蛋白雙向電泳及質(zhì)譜鑒定39
• 3 實驗結(jié)果39-42
• 3.1 線性打靶片段的構(gòu)建結(jié)果39
• 3.2 301△gadA：：kan和301 △gadA-gadB：：kan突變株的構(gòu)建結(jié)果39-40
• 3.3 301野生株、301△gadA、301 △gadB及301 △gadA：：gadB缺失突變株雙向電泳結(jié)果40-41
• 3.4 2457T野生株和2457T△hns突變株GadA/GadB相互作用蛋白磁珠捕獲雙向電泳結(jié)果41
• 3.5 2457T野生株和2457T△hns突變株GadA/GadB相互作用蛋白磁珠捕獲質(zhì)譜鑒定結(jié)果41-42
• 4 討論42-43
• 總結(jié)和展望43-44
• 參考文獻44-49
• 附錄Ⅰ 各種試劑盒使用步驟49-51
• 附錄Ⅱ 實驗中所用儀器設(shè)備51-52
• 附錄Ⅲ 實驗中所用試劑52-54
• 附錄Ⅳ 縮略詞54
• 附錄Ⅴ 實驗中常用溶液配制54-57
• 致謝57

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  本文關(guān)鍵詞：鼠疫菌和志賀菌毒力大質(zhì)粒對細菌蛋白表達譜的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：342242