本文關(guān)鍵詞：SAMP檢測方法的條件優(yōu)化及對(duì)HBV的檢測研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：核酸擴(kuò)增技術(shù)廣泛地應(yīng)用于痕量核酸的檢測中。本論文主要是對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一種單引物引發(fā)的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法(Single Primer-triggered Isothermal Amplification for Double-stranded DNA detection, SAMP)進(jìn)行條件優(yōu)化,并利用此方法對(duì)實(shí)際樣品乙型肝炎病毒(HBV)進(jìn)行了檢測研究。本論文采用正交試驗(yàn)法對(duì)聚合酶、切刻酶、引物用量以及反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化,得到了最優(yōu)的水平組合,聚合酶用量為0.05μL,切刻酶用量為0.4μL,引物濃度為5.0×10-7 M以及溫度為55℃。然后,利用本方法在最優(yōu)的條件下對(duì)質(zhì)粒靶標(biāo)進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示該方法可檢測到1.0×10-17 M,因此,該方法具有較好的檢測限。本論文還采用了納米金比色的方法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行了分析。SAMP體系反應(yīng)35 min后,加入納米金進(jìn)行比色。結(jié)果顯示,高濃度的靶標(biāo)體系有著明顯的顏色變化,而低濃度的靶標(biāo)體系以及空白對(duì)照都沒有發(fā)生顏色變化。因此,利用這種方式,我們可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的靈敏比色檢測。最后,利用此方法在最優(yōu)反應(yīng)條件下對(duì)HBV實(shí)際樣品進(jìn)行檢測,本方法針對(duì)中國常見的HBV-B型、HBV-C型以及HBV-D型這三種類型進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)并檢測,其中HBV-D型的檢測限可達(dá)到1.0×10-17M,可以和熒光定量PCR相媲美。另外,對(duì)于HBV-B型、HBV-C型的檢測還需要進(jìn)一步對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化,以期取得更好的靈敏度。
【關(guān)鍵詞】：PCR 等溫?cái)U(kuò)增 納米金 比色檢測 HBV檢測
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q503;R373.21
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 第一章 綜述8-31
• 1.1 基于工具酶的DNA信號(hào)放大技術(shù)9-23
• 1.1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增9-11
• 1.1.2 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)11-15
• 1.1.2.1 多重置換擴(kuò)增11-13
• 1.1.2.2 切刻引發(fā)的鏈置換反應(yīng)13-14
• 1.1.2.3 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化引發(fā)的鏈置換反應(yīng)14-15
• 1.1.3 指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)15-16
• 1.1.4 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)16-18
• 1.1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)18-21
• 1.1.6 基于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)21-22
• 1.1.7 依賴于解旋酶等溫基因擴(kuò)增技術(shù)22-23
• 1.2 納米金比色技術(shù)23-27
• 1.2.1 納米金的性質(zhì)23-24
• 1.2.2 納米金的DNA修飾24-26
• 1.2.3 納米金比色檢測DNA26-27
• 1.3 乙型肝炎的概述27-29
• 1.3.1 乙型肝炎流行現(xiàn)狀及危害27
• 1.3.2 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)27-28
• 1.3.3 乙型肝炎病毒的基因組DNA結(jié)構(gòu)及復(fù)制28-29
• 1.3.4 乙型肝炎目前的檢測手段29
• 1.4 本論文的研究意義與主要內(nèi)容29-31
• 第二章 SAMP檢測方法條件的優(yōu)化31-51
• 2.1 引言31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分32-38
• 2.2.1 儀器與試劑32-33
• 2.2.2 PBS質(zhì)粒DNA的提取及濃度的估計(jì)33-34
• 2.2.3 熒光定量檢測34-35
• 2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳35-36
• 2.2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳的原理35
• 2.2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳的制備35-36
• 2.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳36-37
• 2.2.5.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理36
• 2.2.5.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳的制備36-37
• 2.2.6 納米金的合成與修飾37-38
• 2.2.6.1 納米金的合成37-38
• 2.2.6.2 納米金的修飾38
• 2.3 結(jié)果與討論38-44
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理38-39
• 2.3.2 引物序列的設(shè)計(jì)39-41
• 2.3.3 PBS質(zhì)粒的濃度估計(jì)41-42
• 2.3.4 熒光檢測結(jié)果42
• 2.3.5 溶解曲線42-43
• 2.3.6 電泳結(jié)果分析43-44
• 2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件44-48
• 2.4.1 反應(yīng)程序設(shè)計(jì)圖44-45
• 2.4.2 三組熒光定量檢測結(jié)果45-48
• 2.5 納米金比色檢測結(jié)果48-50
• 2.6 小結(jié)50-51
• 第三章 SAMP方法在HBV檢測中的應(yīng)用51-61
• 3.1 引言51-52
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分52-55
• 3.2.1 儀器部分52
• 3.2.2 試劑部分52-53
• 3.2.3 HBV DNA的提取53-54
• 3.2.4 HBV DNA的濃度估計(jì)54
• 3.2.5 HBV DNA的實(shí)時(shí)熒光檢測54-55
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論55-60
• 3.3.1 HBV DNA引物序列的設(shè)計(jì)55
• 3.3.2 HBV DNA的濃度的估計(jì)結(jié)果55-56
• 3.3.3 SAMP不同引物的熒光檢測結(jié)果56-58
• 3.3.4 SAMP與熒光定量PCR的檢測結(jié)果比較58
• 3.3.5 SAMP對(duì)HBV B型和C型基因的檢測結(jié)果58-60
• 3.4 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 致謝69-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄70-71

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本文編號(hào)：342204