本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)RD6基因Rvl515c促進(jìn)胞內(nèi)存活及其分子機(jī)理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：由病原菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引發(fā)的結(jié)核病依舊是一個(gè)全球范圍內(nèi)的健康難題,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康,每年都有上百萬(wàn)人感染結(jié)核病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的《全球結(jié)核病報(bào)告2014》年報(bào)指出：2013年新增結(jié)核病感染者900萬(wàn)例,其中死亡人數(shù)達(dá)到150萬(wàn)例,死于HIV共感染的人數(shù)36萬(wàn)。盡管結(jié)核病預(yù)防疫苗以及多種用于治療結(jié)核病的藥物不斷研發(fā)和出現(xiàn),但是隨著多耐藥性菌株和HIV共感染等出現(xiàn),使得結(jié)核病的預(yù)防和治療形式愈加嚴(yán)峻。結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)寄生菌,依賴一系列的特異性毒力因子或者操縱子實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖和持留。利用生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌H37Rv擁有16個(gè)特異性差異識(shí)別區(qū)(Mtb-specific regions of difference, RDs)不存在于牛結(jié)核分枝桿菌或卡介苗等菌株基因組中。RDs區(qū)域系統(tǒng)類型的出現(xiàn)對(duì)于研究結(jié)核分枝桿菌的流行病學(xué)和進(jìn)化研究具有重要的意義。結(jié)核分枝桿菌H37Rv的ESX-1分泌系統(tǒng)的主要組分均定位在RD1區(qū)域,其中包括主要的毒力因子ESAT-6和CFP10。特異性的RDs區(qū)域通常具有重要的免疫原性,是臨床診斷和細(xì)胞免疫檢測(cè)的潛在靶點(diǎn)。結(jié)核分枝桿菌差異識(shí)別區(qū)6 (Regions of difference, RD6)一共包括11個(gè)基因：Rv1506c-Rv1516 c,包括3個(gè)糖代謝途徑中的相關(guān)蛋白(GDP-D-甘露糖脫水酶GmdA、核苷酸差向異構(gòu)酶EpiA、糖基轉(zhuǎn)移酶Rv1516c)以及2個(gè)膜蛋白(Rv1508c和Rv1510)。其中,基因rvl515c編碼一個(gè)功能未知的保守蛋白。目前,RD6基因rv1515c在分枝桿菌中的功能尚不清楚。為探索該基因在分枝桿菌中的功能,本研究以非致病性快生型模式菌株——恥垢分枝桿菌為研究對(duì)象,構(gòu)建MS_Rv1515c基因重組菌株。本研究第一次闡述了RD6區(qū)域基因v1515c在分枝桿菌和宿主相互作用中的功能。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),rv1515c能夠增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在體外的存活能力,并且可能通過(guò)影響脂肪酸的合成而引起一系列菌落表型發(fā)生改變,包括滑動(dòng)能力、單菌落形態(tài)和生物膜的形成。在各種環(huán)境脅迫下維持基因組的穩(wěn)定性是生物生存和繁殖的關(guān)鍵。在各種壓力環(huán)境(H2O2、聯(lián)氨、SDS和低pH值)下,重組恥垢分枝桿菌MS_Rv1515c均具有顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。重組恥垢分枝桿菌感染不同巨噬細(xì)胞(RAW264.7和THP-1)后,我們利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)v1515是否能夠引起相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7中細(xì)胞因子IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組顯著下調(diào)表達(dá)(p0.05)。我們?cè)谌嗽淳奘杉?xì)胞THP-1中得到了相似的結(jié)果。此外,TNF-a和caspase-1的mRNA表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組亦顯著下調(diào)。同時(shí),重組恥垢分枝桿菌在兩種不同巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率均高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照。綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rv1515c蛋白是與結(jié)核分枝桿菌致病性相關(guān)的一種免疫微環(huán)境因子調(diào)控蛋白,增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌在各種壓力環(huán)境以及胞內(nèi)存的活率,參與宿主細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控。我們推測(cè)Rv1515c蛋白是一種潛在的新型抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 RD6 Rv1515c 巨噬細(xì)胞 IL-6 IL-10
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第1章 綜述12-18
• 1.1 引言12
• 1.2 結(jié)核分枝桿菌特異性基因組區(qū)域RDs12-13
• 1.3 潛在特異性抗原——RDs編碼蛋白13-15
• 1.4 RDs在分枝桿菌致病性中的研究15-16
• 1.5 展望16-18
• 第2章 前言18-20
• 第3章 實(shí)驗(yàn)材料和方法20-36
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、載體和細(xì)胞20
• 3.1.2 主要試劑20
• 3.1.3 培養(yǎng)基和溶液的配制20-23
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備23
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法23-36
• 3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成23-24
• 3.2.2 目的基因的獲得24
• 3.2.3 目的基因rv1515c的TA克隆24-25
• 3.2.4 大腸桿菌DH5a、BL21和JM109感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化25
• 3.2.4.1 大腸桿菌感受態(tài)制備25
• 3.2.4.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化(熱激法)25
• 3.2.5 Rv1515c重組蛋白的表達(dá)25-27
• 3.2.5.1 Rv1515c重組質(zhì)粒的構(gòu)建25-26
• 3.2.5.2 Rv1515c重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)26-27
• 3.2.6 恥垢分枝桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化27-28
• 3.2.6.1 恥垢分枝桿菌感受態(tài)制備27
• 3.2.6.2 恥垢分枝桿菌電轉(zhuǎn)化27-28
• 3.2.7 重組蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證(Western blot)28-29
• 3.2.8 重組恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)觀察29
• 3.2.9 滑動(dòng)實(shí)驗(yàn)29
• 3.2.10 恥垢分枝桿菌生物膜培養(yǎng)29
• 3.2.11 重組恥垢分枝桿菌脂肪酸分析29-30
• 3.2.12 重組恥垢分枝桿菌在營(yíng)養(yǎng)饑餓條件以及酸性條件下的存活影響30
• 3.2.13 重組恥垢分枝桿菌對(duì)SDS耐受性檢測(cè)30-31
• 3.2.14 重組恥垢分枝桿菌對(duì)氧化壓力的影響31
• 3.2.15 重組恥垢分支桿菌侵染巨噬細(xì)胞(RAW264.7和THP-1)后胞內(nèi)存活率及細(xì)胞因子檢測(cè)31-36
• 3.2.15.1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)31-32
• 3.2.15.2 重組恥垢分枝桿菌菌懸液的制備32
• 3.2.15.3 重組恥垢分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞32
• 3.2.15.4 重組恥垢分支桿菌感染巨噬細(xì)胞（RAW264.7和THP-1)后細(xì)胞因子檢測(cè)32-36
• 第4章 結(jié)果與分析36-48
• 4.1 rv1515c目的基因擴(kuò)增和鑒定36
• 4.2 成功構(gòu)建Rv1515c大腸桿菌表達(dá)菌株36-37
• 4.3 Rv1515c重組蛋白在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)37-38
• 4.4 成功構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌MS_Rv1515c38
• 4.5 重組恥垢分枝桿菌MS_Rv1515c菌落形態(tài)觀察和生物膜形成38-39
• 4.6 Rv1515c對(duì)恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)無(wú)顯著影響39-40
• 4.7 滑動(dòng)實(shí)驗(yàn)40
• 4.8 重組恥垢分枝桿菌脂肪酸含量檢測(cè)40-41
• 4.9 Rv1515c增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在營(yíng)養(yǎng)饑餓及酸性條件下的存活41-42
• 4.10 Rv1515c增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)SDS的耐受42
• 4.11 Rv1515c增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)H_2O_2的耐受42-43
• 4.12 Rv1515c增強(qiáng)恥垢分支桿菌對(duì)聯(lián)氨的耐受43-44
• 4.14 Rv1515c增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在RAW264.7巨噬細(xì)胞中存活44
• 4.15 Rv1515c引起RAW264.7巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的變化44-45
• 4.16 Rv1515c增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在THP-1巨噬細(xì)胞中存活45-46
• 4.17 Rv1515c引起THP-1巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的變化46-48
• 第5章 結(jié)論與展望48-52
• 5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論48
• 5.2 討論與分析48-50
• 5.3 展望50-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 致謝58-60
• 在學(xué)期間所發(fā)表的文章60

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉民強(qiáng);結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)RD6基因Rvl515c促進(jìn)胞內(nèi)存活及其分子機(jī)理研究[D];西南大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)RD6基因Rvl515c促進(jìn)胞內(nèi)存活及其分子機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：342007