目的:構(gòu)建SigE過表達恥垢分枝桿菌,通過應(yīng)激功能試驗,證實SigE表達成功有活性。觀察SigE過表達恥垢分枝桿菌對多種藥物生存率的變化,及敲除SigE或表達“抗SigE”對藥物生存率的變化,反映SigE對藥物敏感性影響。利用Rpf E促進持留菌復(fù)蘇,檢測復(fù)蘇指數(shù),了解SigE促進細(xì)菌持留影響藥物敏感性的可能機制。經(jīng)高通量測序分析差異基因,進一步了解SigE可能與細(xì)菌的哪些基因有關(guān),為后續(xù)改善分枝桿菌耐藥性的研究奠定基礎(chǔ)。方法:1.PCR擴增出恥垢分枝桿菌sigE基因,克隆入質(zhì)粒p MV261的多克隆位點,構(gòu)建重組p MV261-SigE質(zhì)粒,測序驗證。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌,Western blot檢測SigE的表達。2.通過十二烷基硫酸鈉、酸和過氧化氫應(yīng)激試驗反映SigE對應(yīng)激的影響。DDP和MMC作用后觀察SigE對DNA損傷應(yīng)激的影響。3.設(shè)立含空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌為對照組,采用刃天青作為指示劑的微量滴定板法和菌落計數(shù)法檢測細(xì)菌的生存率反映細(xì)菌對抗結(jié)核藥物的敏感性。4.構(gòu)建sigE基因缺失突變體,驗證缺失sigE基因?qū)u垢分枝桿菌藥物敏感性影響,同時構(gòu)建p MV261-MSMEG-... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

1sigE的PCR增產(chǎn)物

2pMV261-SigE雙酶切鑒定

圖 1.1.3. pMV261-SigE 質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.1.1.3 Results of DNA sequencing of pMV261-SigE圖 1.1.4. Western-blot 檢測 SigE 表達Fig1.1.4 SigE expression detection by Western-blot3,4;5,6are supernatant and precipitation of pMV261-SigE/MS lysate induced at 42 °fo7,8 are supernatant and precipitation of pMV261/MS lysate at 42 °C for 3 h.E 對 SDS 壓力應(yīng)激生存率增強入 SDS 的培養(yǎng)基來模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)的表面壓力環(huán)境[3]，pMV261

【參考文獻】：
期刊論文
[1]福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物表型耐藥與gyrA基因突變特征分析[J]. 魏淑貞,趙永,梁慶福,林建,林淑芳.  中國人獸共患病學(xué)報. 2016(10)
[2]分枝桿菌表達質(zhì)粒的快速構(gòu)建及ClpC2基因功能初步研究[J]. 康月茜,盧楠,孫菱,李岱容,楊春.  免疫學(xué)雜志. 2016(02)
[3]革蘭陰性桿菌中應(yīng)激反應(yīng)機制對細(xì)菌耐藥調(diào)控的研究進展[J]. 周麗芳,趙虎.  國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志. 2014(20)
[4]結(jié)核分枝桿菌sigma因子的功能和調(diào)節(jié)機制[J]. 許瑞,杜先智.  國際呼吸雜志. 2010 (20)

碩士論文
[1]結(jié)核分枝桿菌Cas2（Rv2816c）在脅迫應(yīng)答及胞內(nèi)存活中的作用與分子機理[D]. 黃琴琴.西南大學(xué) 2015



本文編號：3419355