本文關(guān)鍵詞：甲肝病毒3C蛋白酶識(shí)別序列有效性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲型肝炎病毒簡(jiǎn)稱甲肝病毒（HAV）是1973年由Feinslone首先發(fā)現(xiàn)的一種以肝臟損害為主的腸道小RNA病毒。HAV3C蛋白酶是HAV唯一的自身蛋白水解酶，分子量約為20kD，是具有S（絲氨酸）/C（半胱氨酸）性質(zhì)的蛋白酶，其活性中心是Cys-His-Tyr。雖然不直接參與病毒RNA的復(fù)制，但是它對(duì)前體多聚蛋白的正確水解有力的保證了衣殼的形成和病毒的復(fù)制。作為蛋白水解酶，3C蛋白酶就有高度的特異性，在病毒的生命周期中起著非常重要的作用，抑制其切割活性可阻斷病毒復(fù)制，因此3C蛋白酶也是甲肝病毒藥物治療研究的靶點(diǎn)之一。 目前鑒定P3C酶切識(shí)別序列的方法為體外翻譯前體多聚蛋白(兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液)與P3C原核表達(dá)細(xì)胞裂解液30oC孵育7h。經(jīng)免疫沉淀反應(yīng)及SDS-PAGE確定切割條帶，經(jīng)蛋白N端測(cè)序確定其P3C酶切識(shí)別序列。此方法較為復(fù)雜且只能鑒定酶切位點(diǎn)而不能確定其P3C識(shí)別序列。 本實(shí)驗(yàn)利用文獻(xiàn)報(bào)道的ProIL1B-Gluc蛋白酶檢測(cè)系統(tǒng)，經(jīng)基因合成，分子克隆成功構(gòu)建了含有甲肝病毒3C蛋白酶（P3C）六個(gè)不同長(zhǎng)度酶切識(shí)別序列（P2B-P2C）的融合蛋白報(bào)告基因。通過(guò)與P3C共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞測(cè)定熒光值的變化及相應(yīng)的Western blot可以快速精確地鑒定其P3C酶切識(shí)別序列。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)此方法鑒定其P2B-P2C最短酶切識(shí)別序列為L(zhǎng)RTQSF。 同時(shí)檢測(cè)了ProIL1B-Gluc的熒光值與P3C轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的關(guān)系及最佳的檢測(cè)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ProIL1B-Gluc熒光值隨著P3C轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的增加而升高，最佳檢測(cè)時(shí)間應(yīng)在轉(zhuǎn)染12h左右。這說(shuō)明ProIL1B-Gluc對(duì)于HAV3C蛋白酶是一個(gè)較好的報(bào)告基因。 在體外我們驗(yàn)證了隨著ProIL1B-Gluc與P3C孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光值得到了明顯的上升，并有明顯的Western blot切割片段。證明了P3C在體外仍然具有識(shí)別序列的功能。我們的結(jié)果有助于將ProIL1B-Gluc報(bào)告基因向其它小RNA病毒3C蛋白酶進(jìn)行延伸以檢測(cè)與鑒定相應(yīng)的酶切識(shí)別序列，也希望借助于此熒光素酶報(bào)告基因?qū)?C蛋白酶在分子水平可以進(jìn)行更深入的研究。
【關(guān)鍵詞】：甲肝病毒 3C蛋白酶 Gaussia 熒光素酶 酶切位點(diǎn) 白細(xì)胞介素
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373.21
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 甲型肝炎病毒11-14
• 1.1.1 甲型病毒肝炎11
• 1.1.2 甲肝病毒特征11
• 1.1.3 甲肝病毒的致病性11-12
• 1.1.4 甲肝病毒的基因型12
• 1.1.5 甲肝病毒的流行情況12-13
• 1.1.6 甲肝病毒基因組結(jié)構(gòu)13
• 1.1.7 甲肝病毒的預(yù)防13-14
• 1.2 甲肝病毒 3C 蛋白酶14-15
• 1.2.1 3C 蛋白酶的結(jié)構(gòu)14
• 1.2.2 3C 蛋白酶的功能14
• 1.2.3 3C 蛋白酶酶切位點(diǎn)14-15
• 1.2.4 蛋白酶酶切位點(diǎn)的檢測(cè)方法15
• 1.3 Pro-Interleukin-1B-Gaussia luciferase（ProIL1B-Gluc）15-18
• 1.3.1 Gaussia 熒光素酶簡(jiǎn)介15-16
• 1.3.2 Gaussia 熒光素酶的應(yīng)用16
• 1.3.3 ProIL1B-Gluc 融合蛋白熒光素酶報(bào)告基因的應(yīng)用16-18
• 1.4 本課題研究目的與立題依據(jù)18
• 1.4.1 研究目的18
• 1.4.2 立題依據(jù)18
• 1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)18-20
• 1.5.1 質(zhì)粒的構(gòu)建18-19
• 1.5.2 融合蛋白表達(dá)的鑒定19
• 1.5.3 ProIL1B-Gluc 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞熒光值的檢測(cè)19
• 1.5.4 3C 蛋白酶體外切割 ProIL1B-Gluc 報(bào)告基因19
• 1.5.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖19-20
• 第二章 材料與方法20-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)器材20-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 2.1.3 常用試劑配制22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 2.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 PCR 及引物設(shè)計(jì)23-28
• 2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建篩選與擴(kuò)增28-30
• 2.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及融合蛋白表達(dá)的鑒定30-31
• 2.2.4 報(bào)告基因熒光值的檢測(cè)31-32
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-47
• 3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建32-37
• 3.1.1 Pro（9）IL1B-Gluc 質(zhì)粒的構(gòu)建32-33
• 3.1.2 Pro（8-5A）IL1B-Gluc 質(zhì)粒的構(gòu)建33-35
• 3.1.3 IL1B-Gluc 質(zhì)粒的構(gòu)建35-36
• 3.1.4 P3C 質(zhì)粒的構(gòu)建36-37
• 3.2 熒光值的檢測(cè)和融合蛋白表達(dá)的鑒定與分析37-45
• 3.2.1 ProIL1B-Gluc 報(bào)告基因可行性檢測(cè)37-38
• 3.2.2 P9-P5A 單轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞熒光值隨時(shí)間的變化及其相應(yīng)的 Western blot38-40
• 3.2.3 P9-P5A 單轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞熒光值隨質(zhì)粒濃度的變化及相應(yīng)的 Western blot40-41
• 3.2.4 P9-P5A 六個(gè)不同酶切位點(diǎn)長(zhǎng)度報(bào)告基因的可行性41-42
• 3.2.5 ProIL1B-Gluc 熒光值與 P3C 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的關(guān)系42-44
• 3.2.6 ProIL1B-Gluc 與 P3C 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞熒光值隨時(shí)間的變化44-45
• 3.3 ProIL1B-Gluc 與 P3C 體外切割實(shí)驗(yàn)45-47
• 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 文獻(xiàn)51-54
• 作者簡(jiǎn)介54-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王宏;謝廣成;段招軍;;小RNA病毒3C蛋白酶研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2014年05期

2 劉艷;李冰清;孟紅;;小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物[J];生物技術(shù)通報(bào);2014年08期

  本文關(guān)鍵詞：甲肝病毒3C蛋白酶識(shí)別序列有效性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：335975