本文關鍵詞：甲肝病毒3C蛋白酶識別序列有效性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲型肝炎病毒簡稱甲肝病毒（HAV）是1973年由Feinslone首先發(fā)現(xiàn)的一種以肝臟損害為主的腸道小RNA病毒。HAV3C蛋白酶是HAV唯一的自身蛋白水解酶，分子量約為20kD，是具有S（絲氨酸）/C（半胱氨酸）性質的蛋白酶，其活性中心是Cys-His-Tyr。雖然不直接參與病毒RNA的復制，但是它對前體多聚蛋白的正確水解有力的保證了衣殼的形成和病毒的復制。作為蛋白水解酶，3C蛋白酶就有高度的特異性，在病毒的生命周期中起著非常重要的作用，抑制其切割活性可阻斷病毒復制，因此3C蛋白酶也是甲肝病毒藥物治療研究的靶點之一。 目前鑒定P3C酶切識別序列的方法為體外翻譯前體多聚蛋白(兔網(wǎng)織紅細胞裂解液)與P3C原核表達細胞裂解液30oC孵育7h。經(jīng)免疫沉淀反應及SDS-PAGE確定切割條帶，經(jīng)蛋白N端測序確定其P3C酶切識別序列。此方法較為復雜且只能鑒定酶切位點而不能確定其P3C識別序列。 本實驗利用文獻報道的ProIL1B-Gluc蛋白酶檢測系統(tǒng)，經(jīng)基因合成，分子克隆成功構建了含有甲肝病毒3C蛋白酶（P3C）六個不同長度酶切識別序列（P2B-P2C）的融合蛋白報告基因。通過與P3C共轉染293T細胞測定熒光值的變化及相應的Western blot可以快速精確地鑒定其P3C酶切識別序列。本實驗通過此方法鑒定其P2B-P2C最短酶切識別序列為LRTQSF。 同時檢測了ProIL1B-Gluc的熒光值與P3C轉染質粒濃度的關系及最佳的檢測時間。實驗結果表明ProIL1B-Gluc熒光值隨著P3C轉染質粒濃度的增加而升高，最佳檢測時間應在轉染12h左右。這說明ProIL1B-Gluc對于HAV3C蛋白酶是一個較好的報告基因。 在體外我們驗證了隨著ProIL1B-Gluc與P3C孵育時間的延長，熒光值得到了明顯的上升，并有明顯的Western blot切割片段。證明了P3C在體外仍然具有識別序列的功能。我們的結果有助于將ProIL1B-Gluc報告基因向其它小RNA病毒3C蛋白酶進行延伸以檢測與鑒定相應的酶切識別序列，也希望借助于此熒光素酶報告基因對3C蛋白酶在分子水平可以進行更深入的研究。
【關鍵詞】：甲肝病毒 3C蛋白酶 Gaussia 熒光素酶 酶切位點 白細胞介素
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 甲型肝炎病毒11-14
• 1.1.1 甲型病毒肝炎11
• 1.1.2 甲肝病毒特征11
• 1.1.3 甲肝病毒的致病性11-12
• 1.1.4 甲肝病毒的基因型12
• 1.1.5 甲肝病毒的流行情況12-13
• 1.1.6 甲肝病毒基因組結構13
• 1.1.7 甲肝病毒的預防13-14
• 1.2 甲肝病毒 3C 蛋白酶14-15
• 1.2.1 3C 蛋白酶的結構14
• 1.2.2 3C 蛋白酶的功能14
• 1.2.3 3C 蛋白酶酶切位點14-15
• 1.2.4 蛋白酶酶切位點的檢測方法15
• 1.3 Pro-Interleukin-1B-Gaussia luciferase（ProIL1B-Gluc）15-18
• 1.3.1 Gaussia 熒光素酶簡介15-16
• 1.3.2 Gaussia 熒光素酶的應用16
• 1.3.3 ProIL1B-Gluc 融合蛋白熒光素酶報告基因的應用16-18
• 1.4 本課題研究目的與立題依據(jù)18
• 1.4.1 研究目的18
• 1.4.2 立題依據(jù)18
• 1.5 實驗設計18-20
• 1.5.1 質粒的構建18-19
• 1.5.2 融合蛋白表達的鑒定19
• 1.5.3 ProIL1B-Gluc 轉染 293T 細胞熒光值的檢測19
• 1.5.4 3C 蛋白酶體外切割 ProIL1B-Gluc 報告基因19
• 1.5.5 實驗設計圖19-20
• 第二章 材料與方法20-32
• 2.1 實驗器材20-23
• 2.1.1 實驗儀器20-21
• 2.1.2 實驗材料21-22
• 2.1.3 常用試劑配制22-23
• 2.2 實驗方法23-32
• 2.2.1 質粒構建 PCR 及引物設計23-28
• 2.2.2 質粒構建篩選與擴增28-30
• 2.2.3 質粒轉染細胞及融合蛋白表達的鑒定30-31
• 2.2.4 報告基因熒光值的檢測31-32
• 第三章 實驗結果32-47
• 3.1 質粒的構建32-37
• 3.1.1 Pro（9）IL1B-Gluc 質粒的構建32-33
• 3.1.2 Pro（8-5A）IL1B-Gluc 質粒的構建33-35
• 3.1.3 IL1B-Gluc 質粒的構建35-36
• 3.1.4 P3C 質粒的構建36-37
• 3.2 熒光值的檢測和融合蛋白表達的鑒定與分析37-45
• 3.2.1 ProIL1B-Gluc 報告基因可行性檢測37-38
• 3.2.2 P9-P5A 單轉染 293T 細胞熒光值隨時間的變化及其相應的 Western blot38-40
• 3.2.3 P9-P5A 單轉染 293T 細胞熒光值隨質粒濃度的變化及相應的 Western blot40-41
• 3.2.4 P9-P5A 六個不同酶切位點長度報告基因的可行性41-42
• 3.2.5 ProIL1B-Gluc 熒光值與 P3C 轉染質粒濃度的關系42-44
• 3.2.6 ProIL1B-Gluc 與 P3C 共轉染 293T 細胞熒光值隨時間的變化44-45
• 3.3 ProIL1B-Gluc 與 P3C 體外切割實驗45-47
• 討論47-50
• 結論50-51
• 文獻51-54
• 作者簡介54-55
• 致謝55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王宏;謝廣成;段招軍;;小RNA病毒3C蛋白酶研究進展[J];病毒學報;2014年05期

2 劉艷;李冰清;孟紅;;小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物[J];生物技術通報;2014年08期

  本文關鍵詞：甲肝病毒3C蛋白酶識別序列有效性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：335975