本文關(guān)鍵詞：中藥肝豆湯對Wilson病模型TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運通路的分子調(diào)控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson病(Wilson’s disease,WD),是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙性疾病。WD患者因位于13q14.3的ATP7b基因發(fā)生突變,出現(xiàn)銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin,CP)合成障礙及銅在膽汁中的排泄障礙,并導(dǎo)致過量的銅在肝臟、腦、腎臟、角膜等組織臟器中沉積,患者可出現(xiàn)肝硬化、神經(jīng)/精神癥狀、角膜K-F環(huán)等臨床表現(xiàn),嚴(yán)重者可危及生命。WD是少數(shù)可以治療的神經(jīng)遺傳病之一,但以金屬絡(luò)合劑為主的治療方法因毒副反應(yīng)使許多患者不能耐受,嚴(yán)重影響本病患者的病情和預(yù)后。上世紀(jì)70年代以來,本課題單位以中藥肝豆湯治療WD患者獲得良好療效。雖然我們發(fā)現(xiàn)肝豆湯有顯著的細(xì)胞內(nèi)排銅作用,但其產(chǎn)生療效的確切機制尚不明確。本課題在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討肝豆湯對WD模型-TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運通路相關(guān)蛋白的調(diào)控作用,在分子水平初步闡明肝豆湯改善WD患者臨床癥狀的療效機理。目的:研究肝豆湯調(diào)控TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運通路的分子靶點并觀察其相應(yīng)的調(diào)控機制。方法:采用原子吸收法檢測含肝豆湯兔血清作用不同濃度、不同時間點,對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅含量的影響;原子吸收法檢測不同濃度含肝豆湯兔血清作用24h后,對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)微量元素的影響;FITC染色經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)含肝豆湯兔血清孵育后TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b,CTR1,ATOX1,CCS,MT,COX17相關(guān)蛋白的表達(dá);Western blotting法檢測經(jīng)含肝豆湯兔血清作用后ATP7b,CTR1,ATOX1,CCS,MT,COX17相關(guān)蛋白的表達(dá);免疫熒光雙標(biāo)記經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察由含肝豆湯兔血清孵育后TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白的亞細(xì)胞定位變化。結(jié)果:1.含肝豆湯兔血清對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅代謝的調(diào)控(1)原子吸收法實驗結(jié)果表明含肝豆湯兔血清在一定時間和濃度范圍內(nèi)可顯著降低TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅含量,且呈一定的時效和量效關(guān)系。(2)與DL組相比,含肝豆湯兔血清作用24 h后可顯著降低TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅含量,增加鋅含量,降低鐵含量(P0.01)。(3)Western blot法和FITC染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,經(jīng)含肝豆湯兔血清作用后可顯著(P0.01)增加ATP7b蛋白表達(dá)。(4)Western blot法和FITC染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,含肝豆湯兔血清劑量依賴性激活銅代謝相關(guān)蛋白ATOX1、CCS、COX17的表達(dá)(P0.01)。(5)Western blot法和FITC染色流式細(xì)胞儀檢測顯示含肝豆湯兔血清顯著降低CTR1、MT蛋白表達(dá)(P0.01)。2.含肝豆湯兔血清對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白亞細(xì)胞定位和功能表達(dá)的影響(1)免疫熒光結(jié)果顯示,ATP7b蛋白在DL小鼠肝細(xì)胞內(nèi)定位于TGN,位于高銅環(huán)境中則轉(zhuǎn)運至頂端膜區(qū),去除高銅環(huán)境則重新定位于TGN。(2)ATP7b蛋白在TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)不能定位于TGN及頂端膜區(qū)域,去除高銅環(huán)境也不能促使ATP7b蛋白重新定位于TGN。中藥肝豆湯可促使ATP7b蛋白逐步重新定位于TGN。結(jié)論:肝豆湯可能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)銅代謝相關(guān)蛋白,上調(diào)ATP7b、ATOX1、CCS、COX17蛋白表達(dá),抑制CTR1、MT表達(dá),從而發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)排銅作用。肝豆湯可以通過誘導(dǎo)ATP7b蛋白重新定位于TGN,進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)排銅作用,改善WD的臨床癥狀。肝豆湯可通過多靶點、多途徑調(diào)控銅代謝通路達(dá)到降低肝細(xì)胞內(nèi)銅含量的治療效果。
【關(guān)鍵詞】：Wilson病 肝豆湯 TX小鼠 ATP7b蛋白 銅代謝通路 亞細(xì)胞定位
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5;R-332
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 英文縮略詞13-15
• 前言15-19
• 第一部分 中藥肝豆湯對Wilson病模型TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅代謝的分子調(diào)控機制研究19-55
• 1 實驗材料和儀器19-23
• 1.1 細(xì)胞19
• 1.2 藥物19-20
• 1.3 主要試劑20-21
• 1.4 主要試劑配制21-23
• 1.5 主要儀器23
• 2 實驗方法23-33
• 2.1 中藥肝豆湯的制備23-24
• 2.2 含藥血清制備及保存24
• 2.3 TX小鼠基因檢測24-25
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2.5 細(xì)胞計數(shù)26-27
• 2.6 含藥血清處理濃度、時間篩選27
• 2.7 實驗分組及藥物處理27
• 2.8 肝細(xì)胞內(nèi)微量元素含量測定27-28
• 2.9 流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞內(nèi)銅代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)28
• 2.10 Western blot法檢測肝細(xì)胞內(nèi)銅代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)28
• 2.11 蛋白樣品制備28-29
• 2.12 蛋白含量的測定29-30
• 2.13 SDS－PAGE凝膠電泳30-32
• 2.14 統(tǒng)計學(xué)方法32-33
• 3 實驗結(jié)果33-49
• 3.1 含藥血清處理濃度、時間篩選(原子分光光度法)33-34
• 3.2 不同劑量含肝豆湯兔血清對DL、TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)微量元素含量的影響34-37
• 3.2.1 不同劑量含肝豆湯兔血清對DL、TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅含量的影響34-35
• 3.2.2 不同劑量含肝豆湯兔血清對DL、TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)鋅含量的影響35-36
• 3.2.3 不同劑量含肝豆湯兔血清對DL、TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)鐵含量的影響36-37
• 3.3 流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞內(nèi)銅代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)37-43
• 3.3.1 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)Ctr1蛋白表達(dá)的影響37-38
• 3.3.2 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATOX1蛋白表達(dá)的影響38-39
• 3.3.3 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白表達(dá)的影響39-40
• 3.3.4 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)COX17蛋白表達(dá)的影響40-41
• 3.3.5 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)CCS蛋白表達(dá)的影響41-42
• 3.3.6 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)MT蛋白表達(dá)的影響42-43
• 3.4 Western blot法檢測肝細(xì)胞內(nèi)銅代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)43-49
• 3.4.1 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)Ctr1蛋白表達(dá)的影響43-44
• 3.4.2 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATOX1蛋白表達(dá)的影響44-45
• 3.4.3 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白表達(dá)的影響45-46
• 3.4.4 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)COX17蛋白表達(dá)的影響46-47
• 3.4.5 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)CCS蛋白表達(dá)的影響47-48
• 3.4.6 肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)MT蛋白表達(dá)的影響48-49
• 4 討論49-54
• 4.1 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)微量元素的影響49-51
• 4.2 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅代謝相關(guān)蛋白的影響51-54
• 4.2.1 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)Ctr1蛋白表達(dá)的影響51
• 4.2.2 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATOX1蛋白表達(dá)的影響51-52
• 4.2.3 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白表達(dá)的影響52
• 4.2.4 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)COX17蛋白表達(dá)的影響52-53
• 4.2.5 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)CCS蛋白表達(dá)的影響53-54
• 4.2.6 中藥肝豆湯對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)MT蛋白表達(dá)的影響54
• 5 小結(jié)54-55
• 第二部分 中藥肝豆湯對Wilson病模型TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白亞細(xì)胞定位和功能表達(dá)的影響55-65
• 1 實驗材料和儀器55-57
• 1.1 細(xì)胞55
• 1.2 藥物55
• 1.3 主要試劑55-56
• 1.4 主要試劑配制56
• 1.5 主要儀器56-57
• 2 實驗方法57-58
• 2.1 細(xì)胞分離、培養(yǎng)和細(xì)胞計數(shù)57
• 2.2 實驗分組及含藥血清處理57-58
• 2.3 ATP7b蛋白亞細(xì)胞定位檢測58
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)方法58
• 3 結(jié)果58-63
• 3.1 高銅對DL小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白亞細(xì)胞定位的影響58-60
• 3.2 不同劑量含肝豆湯兔血清對TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP7b蛋白亞細(xì)胞定位的影響60-63
• 4 討論63-64
• 5 小結(jié)64-65
• 總結(jié)65-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 綜述74-86
• 參考文獻(xiàn)80-86
• 附錄86-87
• 致謝87

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 葉群榮;胡紀(jì)源;王共強;韓詠竹;饒嬈;趙靜;馬心鋒;張杰;;Wilson病臨床癥狀特征和中醫(yī)證型分析[J];安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年04期

2 王嶠;丁圓;王靜敏;黃瓊輝;趙程峰;劉玉鵬;李溪遠(yuǎn);吳桐菲;宋金青;王玉潔;楊艷玲;;3例Menkes病患兒的臨床與ATP7A基因分析及1例產(chǎn)前診斷研究[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2014年06期

  本文關(guān)鍵詞：中藥肝豆湯對Wilson病模型TX小鼠肝細(xì)胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運通路的分子調(diào)控機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：334498