目的:闡明家蠅（Musca domestica）幼蟲對食物中各種多不飽和脂肪酸的富集能力以及代謝轉化情況,并探究各種多不飽和脂肪酸對家蠅幼蟲生長的影響。在此基礎上,建立適宜家蠅的轉基因方法和技術體系,為實現(xiàn)在家蠅體內進行多不飽和脂肪酸的內源性合成奠定基礎。方法:在基礎飼料中添加不同濃度（3%,6%和12%）的多不飽和脂肪酸（亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸）飼養(yǎng)經過脫脂傳代培養(yǎng)的家蠅幼蟲,提取家蠅幼蟲的總脂肪酸,利用氣相色譜儀進行檢測和分析,測定幼蟲體重進行統(tǒng)計以分析多不飽和脂肪酸對家蠅幼蟲生長的影響。利用piggyBac轉座子載體系統(tǒng),構建Fat1基因的表達載體,然后通過顯微注射法以及電穿孔法將目的基因導入家蠅卵,待發(fā)育為成蠅之后通過檢測綠色熒光蛋白的表達,初步篩選出陽性個體,再提取組織DNA,通過PCR法在分子水平鑒定Fat1基因是否轉入家蠅體內,從而建立轉基因家蠅的技術體系。結果:亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸在家蠅幼蟲體內均能富集,且它們的富集程度隨著食物中多不飽和脂肪酸的添加濃度的升高而增加,其中亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸在幼蟲體內富集的最高占比（指占體內總... 

【文章來源】：貴州醫(yī)科大學貴州省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質粒pUC57-SV40PolyA的PCR鑒定（A）和酶切鑒定(B)

20余為空載體），連同后續(xù)質粒電泳鑒定（圖中未顯示）可能為陽性質粒用于酶切驗證，證明圖3A中泳道4為陽性克隆，確實插入了PromA4片段。中間質粒載體pUC57-PromA4-SV40polyA用來克隆目的基因Fat1，將目的基因Fat1插入該質粒后，即可得到載體pUC57-PromA4-Fat1-SV40polyA。將PromA4-Fat1-SV40polyA 整 個 片 段 用 PCR 方 法 擴 增 出 來 ， 隨 后 插 入 質 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即獲得了最終轉基因實驗所需要的轉基因家蠅表達載體pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（圖4）。在這個載體中，報告基因EGFP被在昆蟲眼部特異性表達的啟動子3×P3所驅動表達，有利于轉基因個體的篩選；而外源目的基因Fat1將被來源于家蠶的肌動蛋白啟動子PromA4所驅動表達。圖4A為重組質粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鑒定

PromA4-Fat1-SV40polyA 整 個 片 段 用 PCR 方 法 擴 增 出 來 ， 隨 后 插 入 質 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即獲得了最終轉基因實驗所需要的轉基因家蠅表達載體pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（圖4）。在這個載體中，報告基因EGFP被在昆蟲眼部特異性表達的啟動子3×P3所驅動表達，有利于轉基因個體的篩選；而外源目的基因Fat1將被來源于家蠶的肌動蛋白啟動子PromA4所驅動表達。圖4A為重組質粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鑒定，其中3號和4號為陽性克隆，經酶切驗證確實插入了目的DNA片段。最后，將陽性克隆測序鑒定，證明目的基因Fat1序列沒有發(fā)生變化，可用于后續(xù)實驗。圖 2 重組質粒 pUC57-SV40PolyA 的 PCR 鑒定（A）和酶切鑒定(B)Fig. 2 Identification

【參考文獻】：
期刊論文
[1]家蠶表皮和體內的游離脂肪酸組成以及對白僵菌的抑制作用[J]. 邢東旭,李慶榮,肖陽,葉明強,劉新濤,楊瓊.  蠶業(yè)科學. 2017(01)
[2]果蠅組織中多不飽和脂肪酸代謝產物——類二十烷酸的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定[J]. 譚量量,沈立榮.  浙江大學學報(農業(yè)與生命科學版). 2016(01)
[3]哺乳動物細胞多不飽和脂肪酸合成酶系的重建將亞油酸代謝轉變?yōu)槎剂┧醄J]. 朱貴明,Abdulmomen Ali Mohammed Saleh,Said Ahmed Bahwal,邱立紅,孫潔,商宇,江旭東,葛堂棟,張濤.  生物工程學報. 2015(02)
[4]家蠅蛆油脂的GC-MS分析及合成生物柴油的研究[J]. 陳倩文,蔡子哲,汪勇,黃妙玲,朱龍平,何國瑞,楊得坡.  可再生能源. 2014(05)
[5]豆天蛾氨基酸及脂肪酸分析與評價[J]. 田華,張義明.  食品科技. 2012(05)
[6]Shiva-1a基因在桿狀病毒中的表達及其表達產物抑菌活性的檢測[J]. 許丹,許信剛,王志昇,閆東東,童德文.  西北農業(yè)學報. 2011(06)
[7]piggyBac轉座子及其轉基因昆蟲的應用[J]. 唐麗莉,陳斌,何正波,李廷景.  安徽農業(yè)科學. 2010(06)
[8]蠅蛆營養(yǎng)成分的測定與評價[J]. 白鋼,張翼翔.  包頭醫(yī)學院學報. 2010(01)
[9]人腦源性神經營養(yǎng)因子基因（hBDNF）在轉基因家蠶絲腺中的特異表達[J]. 段建平,徐漢福,馬三垣,鄧黨軍,王峰,夏慶友.  蠶業(yè)科學. 2009(02)
[10]piggyBac轉座子介導的家蠶細胞轉基因研究初探[J]. 周文林,王崇龍,劉波,曹廣力,薛仁宇,沈衛(wèi)德,貢成良.  蠶業(yè)科學. 2007(01)



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