目的:闡明家蠅（Musca domestica）幼蟲對(duì)食物中各種多不飽和脂肪酸的富集能力以及代謝轉(zhuǎn)化情況,并探究各種多不飽和脂肪酸對(duì)家蠅幼蟲生長的影響。在此基礎(chǔ)上,建立適宜家蠅的轉(zhuǎn)基因方法和技術(shù)體系,為實(shí)現(xiàn)在家蠅體內(nèi)進(jìn)行多不飽和脂肪酸的內(nèi)源性合成奠定基礎(chǔ)。方法:在基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度（3%,6%和12%）的多不飽和脂肪酸（亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸）飼養(yǎng)經(jīng)過脫脂傳代培養(yǎng)的家蠅幼蟲,提取家蠅幼蟲的總脂肪酸,利用氣相色譜儀進(jìn)行檢測和分析,測定幼蟲體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以分析多不飽和脂肪酸對(duì)家蠅幼蟲生長的影響。利用piggyBac轉(zhuǎn)座子載體系統(tǒng),構(gòu)建Fat1基因的表達(dá)載體,然后通過顯微注射法以及電穿孔法將目的基因?qū)爰蚁壜?待發(fā)育為成蠅之后通過檢測綠色熒光蛋白的表達(dá),初步篩選出陽性個(gè)體,再提取組織DNA,通過PCR法在分子水平鑒定Fat1基因是否轉(zhuǎn)入家蠅體內(nèi),從而建立轉(zhuǎn)基因家蠅的技術(shù)體系。結(jié)果:亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸在家蠅幼蟲體內(nèi)均能富集,且它們的富集程度隨著食物中多不飽和脂肪酸的添加濃度的升高而增加,其中亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸在幼蟲體內(nèi)富集的最高占比（指占體內(nèi)總... 

【文章來源】：貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pUC57-SV40PolyA的PCR鑒定（A）和酶切鑒定(B)

20余為空載體），連同后續(xù)質(zhì)粒電泳鑒定（圖中未顯示）可能為陽性質(zhì)粒用于酶切驗(yàn)證，證明圖3A中泳道4為陽性克隆，確實(shí)插入了PromA4片段。中間質(zhì)粒載體pUC57-PromA4-SV40polyA用來克隆目的基因Fat1，將目的基因Fat1插入該質(zhì)粒后，即可得到載體pUC57-PromA4-Fat1-SV40polyA。將PromA4-Fat1-SV40polyA 整 個(gè) 片 段 用 PCR 方 法 擴(kuò) 增 出 來 ， 隨 后 插 入 質(zhì) 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即獲得了最終轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)所需要的轉(zhuǎn)基因家蠅表達(dá)載體pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（圖4）。在這個(gè)載體中，報(bào)告基因EGFP被在昆蟲眼部特異性表達(dá)的啟動(dòng)子3×P3所驅(qū)動(dòng)表達(dá)，有利于轉(zhuǎn)基因個(gè)體的篩選；而外源目的基因Fat1將被來源于家蠶的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子PromA4所驅(qū)動(dòng)表達(dá)。圖4A為重組質(zhì)粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鑒定

PromA4-Fat1-SV40polyA 整 個(gè) 片 段 用 PCR 方 法 擴(kuò) 增 出 來 ， 隨 后 插 入 質(zhì) 粒pBac[3×P3]-EGFPafm，即獲得了最終轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)所需要的轉(zhuǎn)基因家蠅表達(dá)載體pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA（圖4）。在這個(gè)載體中，報(bào)告基因EGFP被在昆蟲眼部特異性表達(dá)的啟動(dòng)子3×P3所驅(qū)動(dòng)表達(dá)，有利于轉(zhuǎn)基因個(gè)體的篩選；而外源目的基因Fat1將被來源于家蠶的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子PromA4所驅(qū)動(dòng)表達(dá)。圖4A為重組質(zhì)粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA的PCR鑒定，其中3號(hào)和4號(hào)為陽性克隆，經(jīng)酶切驗(yàn)證確實(shí)插入了目的DNA片段。最后，將陽性克隆測序鑒定，證明目的基因Fat1序列沒有發(fā)生變化，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖 2 重組質(zhì)粒 pUC57-SV40PolyA 的 PCR 鑒定（A）和酶切鑒定(B)Fig. 2 Identification

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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