肝細(xì)胞核因子1α（HNF1α）作為肝臟中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,以復(fù)合體形式參與調(diào)控多種肝臟特異基因的表達(dá),并涉及蛋白質(zhì)合成、物質(zhì)代謝、損傷修復(fù)等多個(gè)生物學(xué)過程。同時(shí)HNF1α也是維持胰腺功能的重要分子,調(diào)控胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等分子的表達(dá)。在腸和腎中,HNF1α也發(fā)揮著調(diào)控發(fā)育和物質(zhì)吸收的重要作用。在糖代謝中,HNF1α更是扮演著―中心分子‖的作用。HNF1α的突變會(huì)引發(fā)Ⅲ型青少年發(fā)病的成人糖尿病,也就是臨床上所說(shuō)的MODY3,這是一種由單基因突變所導(dǎo)致的負(fù)顯性突變疾病,臨床上表現(xiàn)為25歲前發(fā)病,胰島素分泌不足,血糖嚴(yán)重升高等癥狀,由于患者HNF1α基因突變的晚期糖尿病并發(fā)癥的頻率高,早期診斷與適當(dāng)?shù)闹委熆梢詼p少或延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。因此研究HNF1α調(diào)控機(jī)制和功能有著重要的意義。在研究中我們通過IP-MS發(fā)現(xiàn),HNF1α是一個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。并且我們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的磷酸化位點(diǎn),Ser249位。接下來(lái)我們通過體外磷酸化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),無(wú)論內(nèi)源或者外源ATM蛋白激酶都可以磷酸化HNF1α的Ser249位點(diǎn)。當(dāng)輻射處理引發(fā)DNA損傷活化ATM激酶活性時(shí),HNF1α的磷酸化水平顯著提高。我們發(fā)... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：100 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

LC-MS/MS鑒定HNF1αSer247和Ser249兩個(gè)氨基酸殘基

AT5BIVA 細(xì)胞系（ATM-/-）進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)。在 AT5BIVA 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Flag-ATM 或?qū)φ蛰d體（pCMV-FLAG），轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后用 10Gyγ 射線照射處理，照射后 2 小時(shí)提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖 2B 所示，在回轉(zhuǎn)Flag-ATM 的實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到了 HNF1α 的磷酸化信號(hào)，而在轉(zhuǎn)染對(duì)照載體的實(shí)驗(yàn)組中，沒有檢測(cè)到 HNF1α 的磷酸化信號(hào)。

圖 2C：在 ATM-/-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 Flag-ATM，用60Co 進(jìn)行 10Gy 照射，照射后 2h 收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞并通過免疫共沉淀的方法純化 ATM 激酶，分別以體外誘導(dǎo)表達(dá)的 GST-HNF1α、HNF1α-S247A（92~283）和HNF1α-S249A（92~283）作為體外磷酸化實(shí)驗(yàn)的底物。共孵育復(fù)合物進(jìn)行放射自顯影，并分別用 ATM 抗體和 ATM（s1981）抗體對(duì) ATM 激酶免疫共沉淀產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析。我們使用 ATM 的酶活性特異抑制劑 KU55933 處理 HepG2 細(xì)胞，2 小時(shí)后


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