為了探討副溶血弧菌擬核相關蛋白H-NS對Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS） VP1687-1686基因位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,本研究提取副溶血弧菌hns突變株（Δhns）和野生株（WT）的總RNA,采用引物延伸實驗研究靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點,并根據(jù)產(chǎn)物的豐度判斷H-NS對靶基因的調(diào)控關系;采用實時定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中轉(zhuǎn)錄豐度,以判定H-NS對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關系;將靶基因啟動子區(qū)域DNA序列克隆至lacZ基因上游,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入WT和Δhns中,得到相應的LacZ菌株,通過LacZ報告基因融合實驗研究H-NS對靶基因的調(diào)控關系;用PCR擴增靶基因的啟動子區(qū)DNA序列,并純化His-H-NS蛋白,通過凝膠阻滯實驗（EMSA）研究His-H-NS是否對靶基因啟動子區(qū)具有直接的結合作用。研究結果顯示,T3SS的VP1687-1686只含有一個轉(zhuǎn)錄起始位點,位于翻譯起始位點上游82 bp處,且H-NS能夠抑制其轉(zhuǎn)錄活性,但不能直接結合到VP1687-1686區(qū)的啟動子區(qū)。另外,H-NS對calR的轉(zhuǎn)錄無調(diào)控作用,His-H-NS也不能結合到其啟動子區(qū)。本研究的結果初步說明,H-NS... 

【文章來源】：基因組學與應用生物學. 2020,39(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

FGF/FGFR信號通路

H-NS抑制VP1687的轉(zhuǎn)錄

首先采用引物延伸實驗研究H-NS對calR基因的調(diào)控關系，結果顯示calR的轉(zhuǎn)錄起始位點為T，位于起始密碼子ATG上游156 bp，且WT和Δhns中calR基因的mRNA表達量沒有差異(圖3A)。然后利用qRT-PCR研究calR基因的m RNA在WT和Δhns中轉(zhuǎn)錄豐度，qRT-PCR鑒定結果顯示(圖3B):WT和Δhns中VP1687 m RNA豐度沒有明顯差異，表明H-NS不調(diào)控calR基因的轉(zhuǎn)錄，此結果與引物延伸結果一致。進一步在體外進行的Lac Z報告基因融合實驗結果顯示：Δhns中測得的β-半乳糖苷酶活性與WT基本相同，無顯著性差異(圖3C)，這同樣說明H-NS不調(diào)控calR基因的轉(zhuǎn)錄。最后利用EMSA實驗驗證H-NS是否對calR的啟動子區(qū)DNA具有直接的結合作用，結果顯示H-NS不與calR基因的啟動子區(qū)結合(圖3D)。綜合上述結果：H-NS不調(diào)控calR的轉(zhuǎn)錄，也不能結合到calR的啟動區(qū)，表明H-NS不能通過調(diào)控calR的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控T3SS1的表達。


本文編號：3273380