目的克隆、表達(dá)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)磷酸甘油酸變位酶（EgPGAM）,分析其免疫反應(yīng)性及其在原頭節(jié)、包囊及成蟲(chóng)中的分布情況,對(duì)EgPGAM的診斷價(jià)值進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。方法提取細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, PCR擴(kuò)增EgPGAM基因,測(cè)序。通過(guò)多種生物信息學(xué)軟件分析EgPGAM的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、抗原表位和同源性等。利用Mega 5.0軟件進(jìn)行序列特征分析,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。將EgPGAM基因連接至pET32a表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入大腸埃希菌（E. coli） BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),鎳柱純化,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析其表達(dá)情況并進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）分析。免疫熒光定位分析EgPGAM在原頭節(jié)、包囊及成蟲(chóng)中的分布。采用ELISA評(píng)價(jià)EgPGAM的診斷價(jià)值。結(jié)果 EgPGAM長(zhǎng)756 bp,共編碼251個(gè)氨基酸,編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約28 000,等電點(diǎn)為8.29,不含信號(hào)肽,無(wú)跨膜區(qū)。EgPGAM含有12個(gè)高保守的氨基酸位點(diǎn)、 3個(gè)保守的催化活性位點(diǎn)、 1個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)和7個(gè)B抗原表位。EgPGAM... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志. 2020,38(02)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

Eg PGAM PCR擴(kuò)增結(jié)果

SDS-PAGE結(jié)果顯示，Eg PGAM在E.coli BL21(DE3）中大量表達(dá)，主要以可溶蛋白形式存在于上清中，約為Mr48 000（標(biāo)簽約Mr20 000）（圖4）。Western blotting分析結(jié)果顯示，Eg PGAM可與感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊血清反應(yīng)，不與健康綿羊陰性血清反應(yīng)，具有較好的免疫反應(yīng)性。兔抗Eg PGAM-IgG與原頭節(jié)總蛋白孵育，只顯示單一條帶，大小與Eg PGAM一致（圖4）。2.4 Eg PGAM的免疫熒光定位

免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球蚴階段，Eg PGAM分布于原頭節(jié)表皮層、頂突溝上和包囊生發(fā)層；細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)階段，Eg PGAM均勻地分布于薄壁組織中，蟲(chóng)卵中無(wú)分布（圖5）。2.5 間接ELISA測(cè)定的Eg PGAM敏感性和特異性

【參考文獻(xiàn)】：
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