背景:慢病毒載體作為外源性轉(zhuǎn)基因載體已被廣泛應(yīng)用,但是大鼠甘油二酯激酶γ（diacylglycerol kinase γ,DGKγ）基因慢病毒載體未見(jiàn)報(bào)道。目的:用同源重組的方法構(gòu)建大鼠DGKγ慢病毒過(guò)表達(dá)載體。方法:提取成年SD大鼠腦組織總RNA,以反轉(zhuǎn)錄得到的c DNA作為模板,通過(guò)PCR反應(yīng)分段擴(kuò)增大鼠DGKγ基因CDS區(qū)5’端1 029 bp和3’端1 362 bp,用同源重組技術(shù)將這2個(gè)片段與線性化載體進(jìn)行定向連接,構(gòu)建CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒載體并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定。經(jīng)293T細(xì)胞包裝后產(chǎn)生慢病毒,收集慢病毒感染293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中GFP的表達(dá)并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中DGKγ mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論:CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒載體經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定構(gòu)建成功;經(jīng)CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染后的293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下呈GFP陽(yáng)性,實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示DGKγ mRNA的表達(dá)較空載體組顯著升高（P <0.01）,Western blotting顯示... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)組織工程研究. 2020,24(02)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

DGKγCDS區(qū)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Figure2SequencingresultofPCRproductofCDSofDGKγgeneISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH

HI酶切后質(zhì)粒圖3質(zhì)粒酶切前后瓊脂糖凝膠電泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested圖注：圖中A-C為轉(zhuǎn)染后0，48，72h，箭頭：細(xì)胞融合；D-E為感染后24h，D為空載體慢病毒感染組，E為CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染組。標(biāo)尺=50μm圖5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染后293T細(xì)胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection圖注：圖中A為DGKγmRNA的表達(dá)；B為DGKγ蛋白的表達(dá)。與vector比，aP<0.01,bP<0.001圖6慢病毒感染后293T細(xì)胞中DGKγ的表達(dá)Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection圖注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS區(qū)，F(xiàn)1：片段一，F(xiàn)2：片段二圖4瓊脂糖凝膠電泳分析陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相對(duì)表達(dá)DGKγ蛋白相對(duì)表達(dá)abAB

HI酶切后質(zhì)粒圖3質(zhì)粒酶切前后瓊脂糖凝膠電泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested圖注：圖中A-C為轉(zhuǎn)染后0，48，72h，箭頭：細(xì)胞融合；D-E為感染后24h，D為空載體慢病毒感染組，E為CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染組。標(biāo)尺=50μm圖5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染后293T細(xì)胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection圖注：圖中A為DGKγmRNA的表達(dá)；B為DGKγ蛋白的表達(dá)。與vector比，aP<0.01,bP<0.001圖6慢病毒感染后293T細(xì)胞中DGKγ的表達(dá)Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection圖注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS區(qū)，F(xiàn)1：片段一，F(xiàn)2：片段二圖4瓊脂糖凝膠電泳分析陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相對(duì)表達(dá)DGKγ蛋白相對(duì)表達(dá)abAB

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]GPRC6A過(guò)表達(dá)前列腺癌細(xì)胞株構(gòu)建及EMT相關(guān)研究[J]. 盛彬,楊帆,孫心旖,陳瑤,李莉,楊建一,杜圣家,劉銘.  中國(guó)生物工程雜志. 2017(03)
[2]甘油二酯激酶γ參與大鼠胚胎腦神經(jīng)上皮細(xì)胞的發(fā)育[J]. 牛寶貝,崔慧林,曹錫梅,師亮,馬晉峰,喬從進(jìn).  解剖學(xué)報(bào). 2016(04)
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