背景:慢病毒載體作為外源性轉基因載體已被廣泛應用,但是大鼠甘油二酯激酶γ（diacylglycerol kinase γ,DGKγ）基因慢病毒載體未見報道。目的:用同源重組的方法構建大鼠DGKγ慢病毒過表達載體。方法:提取成年SD大鼠腦組織總RNA,以反轉錄得到的c DNA作為模板,通過PCR反應分段擴增大鼠DGKγ基因CDS區(qū)5’端1 029 bp和3’端1 362 bp,用同源重組技術將這2個片段與線性化載體進行定向連接,構建CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒載體并進行PCR擴增及測序鑒定。經(jīng)293T細胞包裝后產(chǎn)生慢病毒,收集慢病毒感染293T細胞,熒光顯微鏡下觀察細胞中GFP的表達并應用實時熒光定量PCR和Western blotting法檢測細胞中DGKγ mRNA和蛋白的表達。結果與結論:CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒載體經(jīng)PCR擴增和測序鑒定構建成功;經(jīng)CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染后的293T細胞,熒光顯微鏡下呈GFP陽性,實時熒光定量PCR顯示DGKγ mRNA的表達較空載體組顯著升高（P <0.01）,Western blotting顯示... 

【文章來源】：中國組織工程研究. 2020,24(02)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

DGKγCDS區(qū)PCR產(chǎn)物測序結果Figure2SequencingresultofPCRproductofCDSofDGKγgeneISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH

HI酶切后質粒圖3質粒酶切前后瓊脂糖凝膠電泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested圖注：圖中A-C為轉染后0，48，72h，箭頭：細胞融合；D-E為感染后24h，D為空載體慢病毒感染組，E為CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染組。標尺=50μm圖5質粒轉染和慢病毒感染后293T細胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection圖注：圖中A為DGKγmRNA的表達；B為DGKγ蛋白的表達。與vector比，aP<0.01,bP<0.001圖6慢病毒感染后293T細胞中DGKγ的表達Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection圖注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS區(qū)，F(xiàn)1：片段一，F(xiàn)2：片段二圖4瓊脂糖凝膠電泳分析陽性克隆的PCR產(chǎn)物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相對表達DGKγ蛋白相對表達abAB

HI酶切后質粒圖3質粒酶切前后瓊脂糖凝膠電泳Figure3Agarosegelelectrophoresisbeforeandaftervectordigested圖注：圖中A-C為轉染后0，48，72h，箭頭：細胞融合；D-E為感染后24h，D為空載體慢病毒感染組，E為CMV-ratDGKγ-GFP慢病毒感染組。標尺=50μm圖5質粒轉染和慢病毒感染后293T細胞Figure5Photographyof293Tcellsafterplasmidtransfectionandlentiviralinfection圖注：圖中A為DGKγmRNA的表達；B為DGKγ蛋白的表達。與vector比，aP<0.01,bP<0.001圖6慢病毒感染后293T細胞中DGKγ的表達Figure6ExpressionofDGKγin293Tcellsafterlentiviralinfection圖注：M：DNAmarker，CDS：DGKγCDS區(qū)，F(xiàn)1：片段一，F(xiàn)2：片段二圖4瓊脂糖凝膠電泳分析陽性克隆的PCR產(chǎn)物Figure4PCRproductsanalysisofpositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM12bp20001000750500250100bp15000100007500500025001000250CDSF1F2CDSF1F2MPlasmid1Plasmid2DGKγmRAN相對表達DGKγ蛋白相對表達abAB

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3229764