第一部分:金黃色葡萄球菌噬菌體80α Sak的結(jié)構(gòu)生物學研究Sak蛋白最早是在乳酸鏈球菌噬菌體u136中鑒定并命名的,與其它噬菌體來源的重組酶構(gòu)成Sak家族。u136 Sak是目前唯一得到結(jié)構(gòu)解析的Sak家族蛋白,電鏡負染結(jié)構(gòu)表明其為11聚體圓環(huán)狀結(jié)構(gòu),與人源Rad52蛋白N端結(jié)構(gòu)域類似,被認為是Rad52的早期進化源蛋白之一。根據(jù)序列、結(jié)構(gòu)或功能上的相似性,Sak家族被劃為Rad52-like超家族,Sak家族蛋白的相關研究,有利于揭示Rad52類似蛋白的作用機制。金黃色葡萄球菌是一種人類致病菌,最近在金黃色葡萄球菌噬菌體80α基因組復制研究中,鑒定得到80α Sak蛋白,根據(jù)序列和功能上的相似性,該蛋白被劃入Sak家族,并且與人源Rad52端N結(jié)構(gòu)域在體外功能上類似,可能是人源Rad52蛋白的同源蛋白。Rad52是雙鏈DNA斷裂（DSB）修復的核心蛋白之一,可以以Rad51依賴型和Rad51非依賴型兩種方式參與DSB的同源重組修復。為闡明Rad52的具體作用機制,人源Rad52 N端及其與核酸復合物的晶體結(jié)構(gòu)得到解析。研究結(jié)果顯示,Rad52在溶液狀態(tài)下,呈11聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu),內(nèi)部疏... 

【文章來源】：中國科學技術大學安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 金黃色葡萄球菌噬菌體80α Sak結(jié)構(gòu)生物學研究
    第1章 綜述
        1.1 金黃色葡萄球菌噬菌體80α Sak蛋白的發(fā)現(xiàn)
        1.2 Sak家族蛋白簡介
            1.2.1 Sak家族劃分
            1.2.2 Sak家族蛋白研究現(xiàn)狀
        1.3 DNA雙鏈斷裂修復
        1.4 Rad52蛋白參與同源重組的機制研究
        1.5 本篇擬解決問題
    第2章 實驗材料與方法
        2.1 基因克隆及質(zhì)粒構(gòu)建
            2.1.1 基因克隆
            2.1.2 PCR產(chǎn)物回收
            2.1.3 酶切和連接
            2.1.4 感受態(tài)細胞制備
            2.1.5 連接子轉(zhuǎn)化及擴增
            2.1.6 陽性克隆鑒定
        2.2 重組蛋白的表達純化
            2.2.1 80α Sak蛋白的表達
            2.2.2 80α Sak蛋白的純化
        2.3 80α Sak的進化分析及結(jié)構(gòu)預測
        2.4 80α Sak蛋白活性檢測
            2.4.1 等溫滴定量熱實驗
            2.4.2 80α Sak蛋白單鏈退火活性檢測
        2.5 電鏡觀察與數(shù)據(jù)收集
            2.5.1 負染樣品的制備
            2.5.2 冷凍樣品的制備
            2.5.3 冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集
            2.5.4 圖像處理及模型構(gòu)建
        2.6 80α Sak蛋白顆粒大小及聚集狀態(tài)檢測
            2.6.1 動態(tài)光散射(DLS)實驗
            2.6.2 靜態(tài)光散射(SLS)實驗
            2.6.3 S200分子篩標定實驗
        2.7 80α Sak蛋白與ssDNA復合物的負染觀察
    第3章 實驗結(jié)果與討論
        3.1 基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2 重組蛋白的表達鑒定和分離純化
        3.3 80α Sak蛋白與Rad52相關蛋白進化關系分析
        3.4 80 αSak與人源Rad52的結(jié)構(gòu)比對與活性鑒定
            3.4.1 80α Sak與人源Rad52的結(jié)構(gòu)比對
            3.4.2 80α Sak的活性鑒定
        3.5 80αSak蛋白單顆粒負染樣品制備及結(jié)果分析
        3.6 80α Sak單顆粒冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析
        3.7 80αSak聚集狀態(tài)的生化表征
        3.8 80α Sak與單鏈DNA復合物負染分析
    本篇小結(jié)
    參考文獻
第二篇 光修復酶phr相關蛋白表達純化
    第4章 綜述
        4.1 DNA光損傷簡介
        4.2 DNA光損傷修復途徑簡介
        4.3 光修復酶簡介
        4.4 DNA光損傷防護措施
        4.5 本篇擬解決問題
    第5章 實驗材料與方法
        5.1 基因克隆及質(zhì)粒構(gòu)建
            5.1.1 基因克隆
            5.1.2 PCR產(chǎn)物回收及Gibson連接
            5.1.3 連接子轉(zhuǎn)化及擴增
            5.1.4 陽性克隆鑒定
        5.2 重組蛋白的表達純化
            5.2.1 重組蛋白的表達
            5.2.2 重組蛋白的純化
        5.3 鈍頂螺旋藻光修復酶phr的單/雙鏈嘧啶二聚體修復活性測定
    第6章 實驗結(jié)果與討論
        6.1 基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建
        6.2 重組蛋白的表達鑒定和分離純化
        6.3 鈍頂螺旋藻光修復酶phr的單/雙鏈嘧啶二聚體修復活性測定
    本篇小結(jié)
    參考文獻
附錄
致謝
在讀期間發(fā)表的學術論文與取得的研究成果



本文編號：3207357