本文關(guān)鍵詞：TLR配體為佐劑對(duì)呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病的調(diào)節(jié)作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:呼吸道合胞病毒是引起嬰幼兒、老年人以及免疫缺陷者下呼吸道感染的重要病原,甚至?xí)斐伤劳�。但是由于疫苗的安全性�?wèn)題,至今沒(méi)有安全有效的疫苗批準(zhǔn)上市。RSV疫苗增強(qiáng)性免疫病理反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制是研究疫苗的關(guān)鍵。TLR配體作為佐劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型,從而減輕或抑制疫苗增強(qiáng)性免疫病理。本研究選擇了Pam Cys3(TLR-2的配體)、poly(I:C)(TLR-3的配體)、LPS(TLR-4的配體)、Cp G(TLR-9的配體)為佐劑,與FI-RSV疫苗共同免疫野生型C57BL/6小鼠,并用FI-RSV+Al(OH)3免疫M(jìn)y D88-/-C57 BL/6小鼠作為對(duì)照組之一,研究TLR配體為佐劑對(duì)呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病的調(diào)節(jié)作用。方法:1在Hep-2細(xì)胞上培養(yǎng)RSV,測(cè)定RSV滴度。2制備福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)和對(duì)照組疫苗(FI-control)。3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3.1小鼠免疫分別用FI-control,FI-RSV,FI-RSV+Cp G2216,FI-RSV+Al(OH)3,FI-RSV+poly(I:C),FI-RSV+Pam Cys3,FI-RSV+LPS免疫野生型C57 BL/6小鼠,用FI-RSV+Al(OH)3免疫M(jìn)y D88-/-小鼠(C57BL/6背景),正常對(duì)照組用PBS免疫。肌肉注射免疫2次,每次間隔2周。3.2體液免疫檢測(cè)末次免疫后14天小鼠尾靜脈取血,分離血清,用ELISA檢測(cè)抗體Ig G、Ig G1、Ig G2a水平。3.3末次免疫4周后用RSV攻擊被免疫小鼠,每天稱取攻毒小鼠的體重,觀察體重變化。3.4攻毒后5天,處死小鼠,取肺組織、支氣管、肺沖洗液、肺勻漿,做相應(yīng)檢測(cè)3.4.1肺組織病理切片,HE染色,觀察炎癥浸潤(rùn)情況;PAS染色,觀察氣道粘液分泌情況;3.4.2支氣管、肺沖洗液取支氣管、肺沖洗液中的細(xì)胞,瑞氏-吉姆薩染色計(jì)數(shù)炎性細(xì)胞;3.4.3肺勻漿上清用空斑形成實(shí)驗(yàn)滴定病毒滴度;3.4.4血清中和抗體測(cè)定用空斑減少實(shí)驗(yàn)測(cè)中和抗體滴度;3.4.5 ELISA檢測(cè)肺沖洗上清中細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ、IL-1β的含量;3.4.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肺組織中IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、T-bet、Gata-3、ROR-γt、IFN-γ、RSV-N的m RNA表達(dá)。結(jié)果:1培養(yǎng)出RSV,并測(cè)定病毒滴度107.9 pfu/ml。2成功制備福爾馬林滅活的疫苗(FI-RSV)和對(duì)照疫苗(FI-control)。3 ELISA間接法檢測(cè)小鼠血清中Ig G、Ig G1、Ig G2a抗體水平。3.1 Ig GControl組沒(méi)有Ig G產(chǎn)生,FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+LPS組Ig G含量顯著高于FI-control組(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+LPS組Ig G含量顯著高于FI-RSV組(P0.05),FI-RSV+LPS組產(chǎn)生Ig G抗體水平顯著高于各佐劑組(P0.05)。3.2 Ig G1Control組、FI-RSV+Pamcys3組和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組無(wú)Ig G1產(chǎn)生,FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+LPS組Ig G1含量顯著高于FI-control組、FI-RSV組(P0.05),FI-control組和FI-RSV組無(wú)顯著性差異(P0.05)。3.3 Ig G2aControl組、FI-control組、FI-RSV+Pamcys3組和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組無(wú)Ig G2a產(chǎn)生,FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+LPS組與FI-RSV組Ig G2a產(chǎn)生水平無(wú)顯著差異(P0.05)。3.4 Ig G1/Ig G2aFI-RSV+LPS組(0.83)與FI-RSV組(0.96)相比Ig G1/Ig G2a的比值降低,FI-RSV+Cp G組(1.1)、FI-RSV+Al(OH)3組(1.24)、FI-RSV+poly(I:C)組(1.26)與FI-RSV組(0.96)相比Ig G1/Ig G2a的比值升高。4中和抗體Control組無(wú)中和抗體產(chǎn)生,FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Pamcys3組產(chǎn)生的中和抗體水平顯著高于FI-control組(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組和FI-control組無(wú)顯著性差異(P0.05),FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Pamcys3組之間抗體滴度差別不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5小鼠體重變化(攻毒5天后)與Control組相比,從第二天到第六天除FI-RSV+Cp G組外其它各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),FI-RSV+Cp G組從第二天到第四天體重減輕顯著低于Control組(P0.05),第五天、第六天FI-RSV+Cp G組體重下降與Control組無(wú)顯著性差異(P0.05)。6細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示6.1巨噬細(xì)胞各免疫組巨噬細(xì)胞百分比顯著低于Control組(P0.05),FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+LPS組顯著高于FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組和FI-RSV組(P0.05),且FI-RSV+LPS組顯著高于FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-control組(P0.05)。6.2中性粒細(xì)胞各免疫組中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于Control組(P0.05),FI-RSV+LPS組顯著低于除Control組外其它各組(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于其它各組(P0.05)。6.3淋巴細(xì)胞各免疫組淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于Control組(P0.05),FI-RSV+LPS組顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Pamcys3組、FI-RSV+poly(I:C)組(P0.05)。6.4細(xì)胞總數(shù)各免疫組細(xì)胞總數(shù)顯著高于Control組(P0.05),FI-RSV+Cp G組細(xì)胞總數(shù)顯著高于其它各組(P0.05),其它各免疫組差異不顯著,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7肺組織染色Control組、FI-control組、FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3 My D88-/-組7.1 PAS染色的肺組織切片顯示與Control組相比,各免疫組被RSV攻擊后均呈現(xiàn)不同程度的粘液分泌,FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組、FI-RSV+Al(OH)3組的粘液分泌量較多,FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組粘液分泌量次之,FI-control組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Pam Cys3組粘液分泌量較少,FI-RSV+LPS組看不到粘液分泌。7.2 HE染色的肺組織切片顯示Control組小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,肺泡周圍僅存在少量炎性細(xì)胞;FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV+poly(I:C)組和FI-control組小鼠支氣管周圍和肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞增多,肺泡壁輕微增厚;FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組肺泡壁增厚,肺泡間質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞較多,FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組、FI-RSV+Al(OH)3組小鼠經(jīng)RSV攻擊后肺部氣管周圍浸潤(rùn)大量炎癥細(xì)胞,肺泡壁增厚,肺泡腔減小。FI-RSV+LPS組偶見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)肺泡間質(zhì),肺泡壁正常,支氣管周圍偶見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞。8肺勻漿滴定Control組未檢測(cè)到病毒,FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Cp G組病毒滴度顯著低于FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組、FI-control組(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組與FI-control組無(wú)顯著性差異(P0.05)。9 ELISA檢測(cè)肺沖洗上清中細(xì)胞因子顯示9.1 IFN-γFI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Pam Cys3組IFN-γ含量顯著高于Control組、FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+LPS組及FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組(P0.05),其余各免疫組無(wú)明顯差異(P0.05)。9.2 IL-4FI-control組、FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV組IL-4含量顯著高于Control組、FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組(P0.05),FI-RSV+Pam Cys3組顯著高于FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Al(OH)3組(P0.05),其余各組無(wú)顯著差異(P0.05)。9.3 IL-10FI-RSV組IL-10含量顯著高于Control組和其它免疫組(P0.05),FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Pam Cys3組IL-10含量顯著高于FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組(P0.05)。9.4 IL-13FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV組IL-13含量顯著高于Control組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組(P0.05);FI-RSV+Pam Cys3組IL-13含量顯著高于FI-control組、FI-RSV+poly(I:C)組(P0.05),其余各免疫組間無(wú)明顯差異(P0.05)。9.5 IL-17FI-RSV組IL-17含量顯著高于Control組和各免疫組(P0.05),FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組IL-17含量顯著低于FI-RSV+Cp G組(p0.05),其它各組無(wú)顯著性差異(P0.05)。9.6 TNF-αFI-control組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組FI-RSV+Pam Cys3組TNF-α含量顯著高于FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組和Control組(P0.05),其它各組無(wú)顯著性差異(P0.05)。9.7 IL-1βFI-RSV組IL-1β含量顯著高于各免疫組與Control組(P0.05),FI-RSV+LPS組顯著低于FI-control組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Pam Cys3組(P0.05)。9.8 IL-6FI-RSV+Pam Cys3組IL-6含量顯著高于Control組和其它免疫組(P0.05),FI-RSV組IL-6含量顯著高于Control組、FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組(P0.05),其余各免疫組無(wú)明顯差異(P0.05)。10 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)顯示10.1 T-betFI-RSV+Cp G組T-bet表達(dá)量顯著高于除FI-RSV+poly(I:C)以外其它免疫組和Control組(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組T-bet表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+LPS組以外各免疫組和Control組(P0.05),FI-RSV+LPS組、Control組T-bet表達(dá)量顯著低于FI-control組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV組(P0.05),FI-RSV+LPS組和Control組無(wú)顯著差異(P0.05)。10.2 IFN-γFI-RSV+Al(OH)3組IFN-γ表達(dá)顯著高于FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組、FI-control組、FI-RSV+LPS組和Control組(P0.05),其它各組無(wú)顯著性差異(P0.05)。10.3 GATA-3FI-RSV+Al(OH)3組GATA-3的表達(dá)量顯著高于除FI-RSV組以外其余各免疫組和Control組(P0.05),FI-control組、FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組GATA-3的表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+Cp G組以外其余各免疫組和Control組(P0.05),另外,FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組GATA-3的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組(P0.05)。10.4 IL-5FI-RSV+Al(OH)3組IL-5表達(dá)量顯著高于其它各組(P0.05),FI-RSV+LPS組IL-5表達(dá)量顯著低于其它各組(P0.05),FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+poly(I:C)組IL-5表達(dá)量顯著高于除FI-RSV+Al(OH)3組以外其它各組(P0.05),且FI-RSV+Cp G組顯著高于FI-RSV+poly(I:C)組(P0.05)。10.5 IL-10FI-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組IL-10的表達(dá)量顯著低于Control組和其它免疫組(P0.05),且FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+Pam Cys3組IL-10表達(dá)量顯著低于FI-control組、FI-RSV+Cp G組、FI-RSV組(P0.05)。10.6 IL-13FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV+poly(I:C)組IL-13的表達(dá)量顯著高于Control組和其它各免疫組(P0.05),FI-control組、FI-RSV+LPS組IL-13的表達(dá)量顯著低于FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組(P0.05)。10.7 IL-17FI-RSV+LPS組IL-17的表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組以外其它組(P0.05),FI-RSV+Pam Cys3組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組顯著低于FI-control組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV組、FI-RSV+Cp G組(P0.05)。10.8 ROR-γtFI-RSV+LPS組、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組ROR-γt的表達(dá)量顯著低于除FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組以外其它各組(P0.05),FI-RSV+LPS組和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),FI-control組、FI-RSV組、FI-RSV+Al(OH)3組顯著高于FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Cp G組(P0.05),FI-RSV+poly(I:C)組與FI-RSV+Cp G組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。10.9 RSV-N各免疫組RSV-N的表達(dá)顯著高于FI-RSV+Pam Cys3組和Control組(P0.05);FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-組RSV-N的表達(dá)顯著高于除FI-control組以外其它各免疫組(P0.05),FI-RSV+Cp G組、FI-RSV+poly(I:C)組、FI-RSV+Al(OH)3組、FI-RSV+LPS組顯著低于FI-RSV組、FI-control組(P0.05)。結(jié)論:1 TLR配體作為佐劑促使RSV特異性Ig G抗體水平顯著提高,但對(duì)中和抗體無(wú)影響;另外,LPS可顯著提高Ig G2a水平,降低Ig G1/Ig G2a的比值。而My D88缺陷組未見(jiàn)特異性抗體產(chǎn)生。2疫苗對(duì)免疫小鼠具有保護(hù)作用,TLR配體為佐劑對(duì)疫苗的保護(hù)性無(wú)顯著影響。3 TLR4配體LPS作為FI-RSV的佐劑抑制了疫苗增強(qiáng)性疾病的發(fā)生;My D88缺陷、TLR3配體poly(I:C)和TLR2配體Pam Cys3對(duì)疫苗增強(qiáng)性疾病有一定的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：TLR配體 RSV病毒 FI-RSV LPS 佐劑
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-12
• 英文摘要12-21
• 英文縮寫(xiě)21-22
• 前言22-23
• 材料與方法23-36
• 結(jié)果36-43
• 附圖43-60
• 附表60-61
• 討論61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 綜述 疫苗佐劑的研究發(fā)展66-72
• 參考文獻(xiàn)70-72
• 致謝72-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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  本文關(guān)鍵詞：TLR配體為佐劑對(duì)呼吸道合胞病毒疫苗增強(qiáng)性疾病的調(diào)節(jié)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：318650