發(fā)布時(shí)間：2017-04-20 08:19

  本文關(guān)鍵詞：人生長(zhǎng)激素釋放激素類似肽二聚體的生物學(xué)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:人生長(zhǎng)激素釋放激素(h GHRH)由下丘腦分泌,促進(jìn)垂體合成和釋放人生長(zhǎng)激素(h GH)。前原蛋白h GHRH(1-107/8)的成熟由一系列蛋白水解加工步驟,最終的成熟形式是h GHRH(1-44)NH2,h GHRH(1-37)OH和h GHRH(1-40)OH,但其半衰期短和活性低是主要限制。最近研究發(fā)現(xiàn),h GHRH(1-44)分子的N-端1Tyr→Pro-1Pro-或1Pro-延伸或代換,和C端GGC延伸的同源二聚體意外表現(xiàn)出比h GHRH(1-44)NH2更高的生長(zhǎng)激素釋放活性。本論文主要研究四種新型h GHRH二聚體結(jié)構(gòu)和生物活性之間的關(guān)系,為后續(xù)進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。方法:1 GHRH類似物單體的化學(xué)合成和鑒定以固相多肽合成技術(shù)合成新型N端和(或)C端改構(gòu)的GHRH單體肽,其分子量用ESI MS進(jìn)行鑒定,純度用C18-反相HPLC進(jìn)行鑒定。2 GHRH二聚體的形成和鑒定GHRH單體肽在p H=11.5的氨水溶液中,37℃保溫60小時(shí)后形成二聚體肽,凍干后用肽-PAGE電泳進(jìn)行純度鑒定。3 GHRH二聚體肽刺激垂體激素分泌的體外活性分析S-D雌鼠12:12小時(shí)明暗交替飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度26±1℃。大鼠經(jīng)斷頸處死,在30分鐘內(nèi)摘取全部腦垂體。用滅菌的lactated Ringer’s buffer(LRB)沖洗后,垂體立即放到內(nèi)有1 ml LRB的玻璃管中,37℃保溫。玻璃管總保溫5 h,每1小時(shí)后,輕輕吸出試管里面的緩沖液,同時(shí)加入1毫升新鮮的緩沖液。從第3小時(shí)保溫(I3,I4,I5)開(kāi)始,連續(xù)加入1.927μM h GHRH活性多肽。收集的標(biāo)本用ELISA測(cè)定大鼠垂體激素GH、ACTH、LH和PRL。4大鼠垂體生長(zhǎng)激素釋放抑制分析根據(jù)垂體GH釋放活性試驗(yàn)(P1,P2,I3,I4,I5),在I3-I5保溫中,分別添加0.482或1.927μM的生長(zhǎng)激素抑制激素(GHIH)于含有1.927μM GHRH二聚體的管中。無(wú)肽P2保溫做空白和S肽做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。大鼠垂體GH水平用r GH ELISA試劑盒測(cè)定。5 GHRH二聚體肽體外受體結(jié)合反應(yīng)取30只S-D雌鼠的新鮮垂體,勻漿緩沖液研磨重懸,Bradford法測(cè)蛋白濃度。在測(cè)試中,每孔分別加入100μl垂體勻漿液,5種不同濃度的熒光標(biāo)記二聚體肽和對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記GHRH二聚體,總體積300μl。每個(gè)測(cè)試重復(fù)2次,用熒光檢測(cè)儀在490/525 nm波長(zhǎng)下測(cè)熒光值。6大鼠垂體組織熒光染色分析福爾馬林固定S-D大鼠垂體組織切片染色,染色方法如下:玻片浸泡在HEPES緩沖液3次,每次5分鐘。在組織切片上滴加200μl含有76±1熒光強(qiáng)度的FITC-GHRH二聚體的HEPES緩沖液,37℃下孵育1小時(shí)。用HEPES緩沖液洗滌兩次后,在切片上滴加DAPI水溶液(0.01克/毫升),37℃孵育15分鐘。將切片洗滌后用熒光封固劑封片。此染色過(guò)程在暗環(huán)境中進(jìn)行。結(jié)果:1 h GHRH類似物的純度和分子質(zhì)量反相高效液相色譜法分析h GHRH的純度均大于95%,電噴霧質(zhì)譜儀法分析肽的分子質(zhì)量與實(shí)際分子質(zhì)量一致。聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析h GHRH二聚體肽的純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。2 h GHRH肽對(duì)大鼠垂體激素的釋放活性2.1大鼠GH釋放活性:以S肽的凈r GH作為基準(zhǔn),2F或2Y肽的凈r GH值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(P0.05)。2F或2Y的最大凈GH值比S肽高出30.6或36.5%。2D,2E,2F和2Y的活性分別為S肽的104±16.7%,94±32.6%,114±16.6%和122±14.5%。2F肽的I3值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比其P2或S肽的I3更高(P0.01)。2Y肽的I5的r GH孵育值高于S肽的I5的r GH孵育值(P0.01)。2.2 h GHRH類似物對(duì)垂體其它激素釋放活性的分析:與標(biāo)準(zhǔn)S肽一樣,GHRH二聚體肽沒(méi)有增加垂體ACTH、PRL和LH的釋放。3大鼠垂體GH釋放抑制試驗(yàn)在5小時(shí)垂體保溫試驗(yàn)中,在I3-I5孵育期間加入1.927μM的GHRH二聚體肽,0.482或1.927μM的GHIH,對(duì)大鼠GH的釋放產(chǎn)生了明顯的抑制效果。與不加肽的P2值比較,在I3-I5孵育期的低值數(shù)據(jù)表明,GHIH具有明顯的抑制的大鼠GH釋放作用,且具有劑量和時(shí)間依賴關(guān)系(P0.05或0.01)。4 GHRH二聚體肽與垂體GHRH受體結(jié)合試驗(yàn)S,2D,2E,2F和2Y肽與大鼠垂體細(xì)胞的受體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)顯示具有較高的特異性。h GHRH肽的結(jié)合強(qiáng)弱為2F2D2Y2ES,因而2F肽具有最大的垂體勻漿結(jié)合力(P0.05)。5大鼠垂體組織熒光染色經(jīng)FITC標(biāo)記的GHRH二聚體肽染色分布于細(xì)胞膜上,熒光染色的強(qiáng)度為2F2D2E2YS,其中2F肽在垂體細(xì)胞膜上的分布最強(qiáng)。結(jié)論:1通過(guò)大鼠GH釋放/抑制活性分析、受體結(jié)合試驗(yàn)以及組織化學(xué)染色可以看出,h GHRH二聚體肽的2D,2E,2F和2Y具有良好的大鼠GH釋放活性和相似的垂體激素釋放特異性。2 2F具有最強(qiáng)的和最持久的活性,最強(qiáng)的垂體勻漿結(jié)合能力,垂體細(xì)胞染色中表現(xiàn)最為明顯,這表明在垂體細(xì)胞膜上2F肽和GHRH受體之間的親和力最強(qiáng)。因此,2F肽可以成為將來(lái)動(dòng)物試驗(yàn)的一個(gè)不錯(cuò)的選擇。3在GHRH促使GH方面釋放,兩個(gè)N末端GHRH二聚體肽比一個(gè)N末端的h GHRH1 44㖞NH2的效果更好。
【關(guān)鍵詞】：人生長(zhǎng)激素釋放激素類似肽 二聚體肽 生物學(xué)活性
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R335
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫(xiě)11-12
• 前言12-13
• 材料和方法13-17
• 結(jié)果17-20
• 附圖20-25
• 附表25-29
• 討論29-31
• 結(jié)論31
• 參考文獻(xiàn)31-34
• 綜述 生長(zhǎng)激素釋放激素類似物的研究進(jìn)展34-43
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 致謝43-44
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷44

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