本文關(guān)鍵詞：SCF信號(hào)對(duì)肥大細(xì)胞IL-13的產(chǎn)生及遷移性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:肥大細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞,其前體細(xì)胞在組織中進(jìn)一步發(fā)育成熟[1]。肥大細(xì)胞一方面可作為效應(yīng)細(xì)胞在變態(tài)反應(yīng)中起作用,另一方面也可通過表達(dá)協(xié)同刺激分子和分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生物學(xué)過程。肥大細(xì)胞表面FcεRⅠ的交聯(lián)反應(yīng)引發(fā)組胺等炎癥介質(zhì)的釋放,從而介導(dǎo)過敏反應(yīng)的早期相。更為重要的是,激活的肥大細(xì)胞可通過合成和釋放嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-8等趨化因子,募集嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等到達(dá)組織局部,參與過敏反應(yīng)的晚期相反應(yīng)。干細(xì)胞因子(Stem Cell Factors,SCF)也稱為肥大細(xì)胞生長因子。它來源于成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。SCF是體內(nèi)重要的生長因子,可以促進(jìn)造血前體細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和生殖細(xì)胞等多種細(xì)胞的增生、遷移、存活和分化。SCF信號(hào)對(duì)于肥大細(xì)胞的生長、存活、粘附、激活等生物學(xué)活性也具有重要作用。但有研究表明哮喘患者血清和痰液中SCF含量升高,但SCF與哮喘發(fā)病之間的關(guān)系不清[2-3]。支氣管哮喘(簡稱哮喘)是常見的慢性呼吸道疾病之一,其發(fā)病率近年呈上升趨勢(shì)[4]。哮喘是一種多種細(xì)胞(包括嗜酸性粒細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等)參與的慢性氣道炎癥,以氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要特征。有證據(jù)顯示哮喘癥狀的嚴(yán)重性與氣道中肥大細(xì)胞積聚的數(shù)量及其活化的程度相關(guān)。哮喘的發(fā)病與Th2型細(xì)胞因子IL-13有密切聯(lián)系已為我們所熟知[5]。IL-13主要由活化的T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生。其可通過促進(jìn)成肌纖維細(xì)胞的生成、膠原的沉積[6]以及氣道上皮細(xì)胞的化生[7]而介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[8]的形成。最近的研究表明SCF與過敏原介導(dǎo)的氣道重塑[9]相關(guān),但詳細(xì)的機(jī)制不清。由于肥大細(xì)胞在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中均起到重要作用,因此為了說明SCF與哮喘發(fā)病之間的關(guān)系,有必要探討SCF信號(hào)對(duì)肥大細(xì)胞IL-13的產(chǎn)生及遷移性的影響。目的:研究SCF信號(hào)對(duì)肥大細(xì)胞P815 IL-13的產(chǎn)生及遷移性的影響。方法:1.采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和Western blot檢測(cè)肥大細(xì)胞P815 c-Kit受體的表達(dá)。2.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)不同濃度(1-100ng/ml)SCF刺激P815細(xì)胞不同時(shí)間(6h,12h,24h,48h,72h)后,IL-13的產(chǎn)生情況。3.分別使用MEK/ERK通路抑制劑U0126(10μM)、JAK/STAT3通路抑制劑JSI-124(100n M)、PI3K/Akt通路抑制劑Wortmannin(1μM)、CREB阻斷劑H-89(20μM)、NF-κB阻斷劑PDTC(50μM)預(yù)處理P815細(xì)胞30min后,再用SCF(50ng/ml)刺激6h,ELISA檢測(cè)P815細(xì)胞IL-13產(chǎn)生的情況。4.Western blot檢測(cè)肥大細(xì)胞P815在SCF(50ng/ml)刺激不同時(shí)間(0min,15min,30min,60min)后,信號(hào)通路蛋白Erk磷酸化情況。5.電泳遷移率滯后試驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測(cè)肥大細(xì)胞P815在SCF(50ng/ml)刺激1h后,核轉(zhuǎn)錄因子CREB的活化情況。6.收集SCF(50ng/ml)刺激6h后P815細(xì)胞,進(jìn)行熒光定量PCR,檢測(cè)可以結(jié)合到IL-13 3’-UTR區(qū)mi RNAs(mi R-200c、mi R-194、mi R-34b-5p、mi R-449b、mi R-200b、mi R-362-3p、mi R-98、mi R-410、mi R-429、mi R-34a、mi R-34c及mi R-449c)的表達(dá)情況。7.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),觀察肥大細(xì)胞P815在SCF(10ng/ml)單獨(dú)刺激或者先用Anti-CCL2(1ng/ml)抗體或者先用CCL2同型對(duì)照抗體(1ng/ml)預(yù)處理2h,再用SCF(10ng/ml)刺激后遷移細(xì)胞數(shù)的情況。結(jié)果:1.肥大細(xì)胞P815中存在c-Kit的表達(dá),幾乎所有肥大細(xì)胞P815細(xì)胞膜表面存在c-Kit受體的表達(dá)。2.不同濃度的SCF(1-100ng/ml)刺激P815細(xì)胞6h均可促進(jìn)其產(chǎn)生IL-13(p0.01),以10-50ng/ml效果最為明顯。50ng/ml的SCF作用于P815細(xì)胞不同時(shí)間(6h,12h,24h,48h,72h),IL-13產(chǎn)生明顯升高(p0.01)。另外,SCF(50ng/ml)刺激P815細(xì)胞6h,IL-6分泌也增加(p0.05),而IFN-γ和IL-10分泌降低(p0.05)。3.與SCF單刺激組相比,JSI-124+SCF組、Wortmannin+SCF組和PDTC+SCF組IL-13的產(chǎn)生無明顯差異,而U0126+SCF組和H-89+SCF組IL-13的產(chǎn)生明顯降低(p0.01);4.P815細(xì)胞未刺激組磷酸化Erk1/2條帶較弱,而SCF(50ng/ml)刺激15min后磷酸化Erk1/2條帶亮度有所增加,30min達(dá)到高峰,60min呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。5.未刺激組CREB滯后帶較弱,而SCF(50ng/ml)刺激P815細(xì)胞1h后出現(xiàn)明顯的CREB滯后帶。6.SCF(50ng/ml)刺激肥大細(xì)胞P815 6h后,mi R-200c、mi R-34b-5p及mi R-449b的表達(dá)升高,mi R-200b、mi R-362-3p、mi R-98、mi R-410、mi R-429、mi R-34a、mi R-34c、mi R-449c及mi R-362-3p的表達(dá)降低,其中以mi R-449c的降低最為明顯。7.與未刺激組相比,SCF(10ng/ml)刺激P815細(xì)胞不同時(shí)間(3h,6h,12h,24h)后遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增多(p0.01)。與SCF(10ng/ml)單刺激組相比,Anti-CCL2+SCF(10ng/ml)組P815遷移細(xì)胞數(shù)明顯降低(p0.01)。結(jié)論:1.幾乎所有肥大細(xì)胞P815細(xì)胞膜表面存在c-Kit受體的表達(dá)。2.SCF通過啟動(dòng)MEK-ERK-CREB信號(hào)通路誘導(dǎo)肥大細(xì)胞P815產(chǎn)生IL-13。3.SCF能夠加快P815細(xì)胞的遷移,并且此作用與CCL2相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：干細(xì)胞因子 P815細(xì)胞 c-Kit 白介素-13 趨化因子配體2 MEK-ERK-CREB信號(hào) 細(xì)胞遷移
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 引言12-14
• 材料和方法14-22
• 結(jié)果22-34
• 討論34-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 致謝47-48
• 附錄48-62
• 附錄A 英文縮略詞表48-50
• 附錄B 常用試劑配制50-52
• 附錄C 個(gè)人簡歷及發(fā)表論文52-53
• 附錄D 綜述53-62
• 參考文獻(xiàn)59-62

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本文編號(hào)：315822