本文關(guān)鍵詞：利用不同方法對(duì)大鼠胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白表達(dá)載體的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：2008年Mia Buehr和Ping Li等成功建立了大鼠胚胎干細(xì)胞(Rat embryonic stem cells,r ESCs)系,為干細(xì)胞研究領(lǐng)域提供了一個(gè)全新的研究模型。大鼠因其獨(dú)特的物種屬性及其在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等特殊疾病的研究領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),一直以來被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等自然科學(xué)研究領(lǐng)域。而r ESCs的出現(xiàn)為建立基因修飾的大鼠動(dòng)物模型提供了更優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)大鼠轉(zhuǎn)基因研究方法的改進(jìn)起到關(guān)鍵作用。然而,對(duì)r ESCs進(jìn)行有效的遺傳操作是生產(chǎn)基因修飾的大鼠動(dòng)物模型的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過將紅色熒光蛋白表達(dá)載體導(dǎo)入r ESCs,尋找最優(yōu)的r ESCs轉(zhuǎn)基因方法,為建立基因修飾的大鼠動(dòng)物模型提供新的思路和方法,從而為r ESCs在干細(xì)胞研究和異種移植等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。目的本實(shí)驗(yàn)以大鼠胚胎干細(xì)胞(r ESCs)為研究對(duì)象,通過比較利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染及核轉(zhuǎn)染等轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達(dá)紅色熒光蛋白(red fluorescence protein,RFP)的p EF1alpha-Ds Red-Express2 Vector質(zhì)粒載體導(dǎo)入r ESCs,并比較不同轉(zhuǎn)染技術(shù)的轉(zhuǎn)基因效率,以期尋找更好的r ESCs轉(zhuǎn)基因方法,并探討轉(zhuǎn)基因過程對(duì)r ESCs干細(xì)胞特性是否產(chǎn)生影響。方法利用脂質(zhì)體法、電穿孔法和核轉(zhuǎn)染法等轉(zhuǎn)染方法將表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的p EF1alpha-Ds Red-Express2 Vector質(zhì)粒載體導(dǎo)入r ESCs中,轉(zhuǎn)染后即運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色,統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染后r ESCs的細(xì)胞存活率;并于48 h后觀察r ESCs內(nèi)紅熒光蛋白表達(dá)情況,從而比較不同轉(zhuǎn)染技術(shù)之間的轉(zhuǎn)染效率差異,確定效率最佳的轉(zhuǎn)染技術(shù)和轉(zhuǎn)染條件。然后,運(yùn)用堿性磷酸酶染色(AP)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)和免疫熒光染色等方法對(duì)轉(zhuǎn)染前后的r ESCs進(jìn)行干細(xì)胞特性方面的檢測(cè),探討轉(zhuǎn)基因過程對(duì)r ESCs干細(xì)胞特性的影響。結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)采取的幾種轉(zhuǎn)染方法中,核轉(zhuǎn)染技術(shù)能獲得較高的轉(zhuǎn)染效率;且在核轉(zhuǎn)染條件為A13時(shí),可獲得最高的r ESCs紅熒光蛋白轉(zhuǎn)染效率,為(39.63±1.75)%,且核轉(zhuǎn)染后r ESCs的細(xì)胞死亡率為(51.17±10.40)%。經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染,r ESCs的堿性磷酸酶染色結(jié)果仍為陽性;同時(shí),RT-PCR和免疫熒光染色結(jié)果表明核轉(zhuǎn)染前后r ESCs內(nèi)的Oct4,Nanog,Sox2等細(xì)胞多能性基因的表達(dá)均沒有出現(xiàn)明顯差異。結(jié)論相較于脂質(zhì)體法和電穿孔法,核轉(zhuǎn)染技術(shù)更適用于r ESCs的基因修飾,且核轉(zhuǎn)染過程對(duì)r ESCs的干細(xì)胞特性無明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：大鼠胚胎干細(xì)胞 紅色熒光蛋白 轉(zhuǎn)染效率 干細(xì)胞多能性標(biāo)志基因
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R321
【目錄】：

• 全文主要縮略語4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-34
• 結(jié)果34-42
• 討論42-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 綜述56-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況及科研工作情況69-70
• 致謝70-71

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7 張h

本文編號(hào)：315913