本文關(guān)鍵詞：臍帶華通膠源間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化潛能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過(guò)臍帶華通膠源間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)和體內(nèi)移植觀察其向心肌細(xì)胞分化的特性,選擇心肌重建新的優(yōu)良種子細(xì)胞,并在體內(nèi)外分子、細(xì)胞、整體水平上,確證華通膠源間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌分化潛能,為華通膠源間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)重建心肌臨床研究奠定理論基礎(chǔ)。方法:提取臍帶華通膠,將華通膠剪成細(xì)小的組織塊,使用貼壁法分離間充質(zhì)干細(xì)胞,組織塊貼壁培養(yǎng)12-14天細(xì)胞融合為原代細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到80-90%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。取第二代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)表面標(biāo)記CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR。使用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法進(jìn)行細(xì)胞增殖特性檢測(cè),取生長(zhǎng)良好的第2代WJMSCs進(jìn)行成骨、成脂肪、成軟骨分化鑒定。心肌特異分化基因表達(dá)特征檢測(cè),應(yīng)用QT-PCR定量檢測(cè)WJMSCs心肌早期特異轉(zhuǎn)錄因子Isl-1、flk-1、Nkx2.5表達(dá)水平;在5-氮胞苷誘導(dǎo)下向心肌細(xì)胞分化和心肌細(xì)胞特異標(biāo)志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43檢測(cè)。制作大鼠心肌梗死模型,在模型建立14天后在體內(nèi)進(jìn)行WJMSCs移植,移植量為0.5ml計(jì)2×106細(xì)胞,心梗大鼠移植WJMSCs一個(gè)月,行超聲心動(dòng)圖檢測(cè),觀察心功能的變化;免疫熒光共聚焦、m RNA水平、蛋白水平進(jìn)行心肌細(xì)胞特異標(biāo)志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43檢測(cè)。結(jié)果:臍帶華通膠經(jīng)組織塊貼壁法培養(yǎng),6天WJMSCs從組織塊中爬出,呈梭型貼壁生長(zhǎng),12-14天WJMSCs在組織塊周圍生長(zhǎng)并接近融合,經(jīng)傳代后24h,細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,6天后,細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)生長(zhǎng)期,增殖減慢,8天后細(xì)胞進(jìn)入衰亡期,取2代生長(zhǎng)良好的WJMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志,WJMSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC,不表達(dá)CD34、CD45、及HLA-DR,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。WJMSCs在成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后,細(xì)胞堿性磷酸酶、茜素紅、油紅“O”、亞甲藍(lán)染色呈陽(yáng)性反應(yīng),表明WJMSCs可向成骨、成脂肪、成軟骨細(xì)胞分化。QT-PCR定量檢測(cè)WJMSCs表達(dá)心肌早期特異轉(zhuǎn)錄因子flk-1、Isl-1、Nkx2.5;WJMSCs在5-氮胞苷誘導(dǎo)下可以向心肌樣細(xì)胞分化,表達(dá)心肌細(xì)胞特異標(biāo)志α-actin,Tn T,GATA-4,connexin-43。大鼠經(jīng)開胸結(jié)扎前降支,結(jié)扎后出現(xiàn)大面積心肌表面變蒼白、且伴有室壁運(yùn)動(dòng)紊亂或減弱,心電圖檢查可見(jiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上相鄰導(dǎo)聯(lián)Q波形成且1/4R波,寬度0.04 s,左室射血分?jǐn)?shù)≤45%,大鼠心肌梗死模型制作成功;細(xì)胞移植后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查,移植組LVEF治療后(61.62±8.74%)較治療前(43.02±3.67%)及對(duì)照組治療后(43.43±4.2%)相比均顯著增高(P0.01);LAVW移植組LAVW治療后(1.84±0.36 mm)較治療前(1.28±0.45 mm)及對(duì)照組治療后(1.21±0.31 mm)相比顯著增高(P0.5);免疫熒光共聚焦、m RNA水平、蛋白水平進(jìn)行心肌細(xì)胞特異標(biāo)志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43檢測(cè),WJMSCs移植組明顯高于對(duì)照組。結(jié)論:研究表明WJMSCs在體外培養(yǎng)具有多向分化的潛能,具有心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子,經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)可向心肌細(xì)胞分化,表達(dá)心肌細(xì)胞所特有的細(xì)胞表面標(biāo)志,證實(shí)WJMSCs在體外可以向心肌細(xì)胞分化;WJMSCs在體外移植到心肌梗死大鼠體內(nèi)后,可明顯改善大鼠心功能,病理檢查心肌特異標(biāo)志物明顯高于對(duì)照組,在實(shí)驗(yàn)大鼠心梗模型上證實(shí)了WJMSCs在體內(nèi)可以向心肌細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞 大鼠 心肌梗死 心肌細(xì)胞 分化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮略詞11-13
• 第1章 前言13-20
• 1.1 干細(xì)胞研究概述和干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)14-16
• 1.1.1 胚胎干細(xì)胞（ESCs）：14-15
• 1.1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)：15
• 1.1.3 臍血及臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞：15
• 1.1.4 i PS細(xì)胞：15-16
• 1.2 用于心血管疾病治療的干細(xì)胞研究16-17
• 1.2.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMMCs）：16
• 1.2.2 骨骼肌干細(xì)胞：16
• 1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）：16
• 1.2.4 胚胎干細(xì)胞(ESCs)：16-17
• 1.2.5 同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞：17
• 1.2.6 羊水干細(xì)胞：17
• 1.2.7 臍帶華通膠源間充質(zhì)干細(xì)胞（WJMSCs）：17
• 1.3 缺血性心肌病的治療現(xiàn)狀17-18
• 1.4 缺血性心肌病的細(xì)胞學(xué)治療現(xiàn)狀與趨勢(shì)18-20
• 第2章 材料與方法20-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-24
• 2.1.1 臍帶來(lái)源20
• 2.1.2 大鼠來(lái)源20
• 2.1.3 主要試劑20-22
• 2.1.4 主要儀器及設(shè)備22
• 2.1.5 配置試劑22-24
• 2.2 研究方法24-33
• 2.2.1 體外細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定分化24-31
• 2.2.2 體內(nèi)WJMSCs向心肌細(xì)胞分化的研究31-33
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理33-34
• 第3章 結(jié)果34-42
• 3.1 WJMSCs生長(zhǎng)特點(diǎn)34-35
• 3.2 WJMSCs表面標(biāo)記物的檢測(cè)35-36
• 3.3 WJMSCs成骨、成脂肪、成軟骨的誘導(dǎo)分化36-37
• 3.4 心肌早期特異轉(zhuǎn)錄因子ISl-1、flk-1、Nkx2.5 表達(dá)37
• 3.5 免疫熒光檢測(cè)心肌特異標(biāo)記物37-38
• 3.6 大鼠心肌梗死模型的制備和細(xì)胞移植38
• 3.7 WJMSCs移植對(duì)大鼠心功能影響38-39
• 3.8 WJMSCs移植后免疫熒光共聚焦檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞特異標(biāo)志39-40
• 3.9 WJMSCs移植后mRNA水平檢測(cè)心肌特異性標(biāo)志物40-41
• 3.10 WJMSCs移植后蛋白水平檢測(cè)心肌特異性標(biāo)志物41-42
• 第4章 結(jié)論42-43
• 第5章 討論43-48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 作者簡(jiǎn)介及在讀碩士期間取得的科研成果55-58
• 致謝58

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本文編號(hào)：315706