發(fā)布時間：2021-03-24 06:20

　　目的使用CRISPR/Cas9技術構建血管內皮生長因子b（Vascular endothelial growth factor b,Vegfb）敲除斑馬魚模型。方法設計CRISPR/Cas9位點,體外轉錄單鏈向導RNA（single guide RNA,sg RNA）和Cas9 RNA,通過斑馬魚受精卵顯微注射,評價sg RNA效率。對子代斑馬魚進行基因測序并篩選,最后獲得基因敲除的純合子斑馬魚Vegf-b-/-。結果針對1個基因位點設計并構建了2個sg RNA,選擇效率最高的sg RNA1進行斑馬魚受精卵顯微注射,獲得嵌合體F0代胚胎,篩選出穩(wěn)定遺傳的founder。并進一步通過三代篩選鑒定獲得可穩(wěn)定遺傳的Vegf-b敲除的斑馬魚系,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其血管發(fā)育和心臟形態(tài)異常。結論通過CRISPR/Cas9技術,可以穩(wěn)定可靠的構建Vegf-b基因敲除斑馬魚,并證明Vegf-b影響斑馬魚體節(jié)間血管的發(fā)育和心臟功能,為后續(xù)Vegf-b功能研究奠定了重要的基礎。 

【文章來源】：廣東藥科大學學報. 2020,36(02)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

基因敲除斑馬魚模型的構建過程

測序結果顯示，sg RNA1(圖2 A)出現(xiàn)明顯的套峰，且重疊峰出現(xiàn)在Vegf-b靶位點(黑色線框所標注的序列)酶切位點附近，而sgRNA2為單峰(圖2B)，確定sg RNA1誘導突變有效，因此，本研究使用sgRNA1進行下一步的實驗。3.2 Vegf-b敲除斑馬魚的構建及篩選

F0代嵌合體成年后與同品系的野生型雜交，胚胎通過堿裂法測序，不能穩(wěn)定遺傳的F0代只有單峰，可以穩(wěn)定遺傳的有明顯套峰，稱之為founder(圖3 A)。讓founder與野生型雜交獲得F1代，待F1代成年后用堿裂法測序，沒有基因突變的野生型只有單峰，有基因突變的斑馬魚雜合子Vegf-b+/-有明顯套峰(圖3 B)。對F1代敲除雜合子進行基因克隆測序，發(fā)現(xiàn)其基因序列缺失TC 2 bp堿基(圖3 C)。讓缺失TC 2 bp的F1代雜合子和野生型雜交獲得F2代，待F2代成年后用相同方法篩選出基因型相同的F2代敲除雜合子，野生型只有單峰，F(xiàn)2代敲除雜合子有明顯套峰(圖3 D)。讓F2代敲除雜合子Vegf-b+/-自交，相同的方法進行篩選，發(fā)現(xiàn)雜合子Vegf-b+/-有明顯套峰，沒有基因突變的野生型或者有基因突變的純合子Vegf-b-/-(圖3 E)只有單峰，進一步通過序列比對發(fā)現(xiàn)，野生型堿基沒有缺失，純合子Vegf-b-/-缺失TC 2 bp堿基(圖3 F)。最終獲得可穩(wěn)定遺傳的Vegf-b敲除的斑馬魚系。3.3 斑馬魚胚胎心血管發(fā)育評價

【參考文獻】：
期刊論文
[1]模式生物斑馬魚在聽覺領域的應用[J]. 劉可春,高燕,張云,何秋霞,韓利文,李寧,季秀娜,孫晨.  山東科學. 2019(05)
[2]跑臺運動對高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠比目魚肌脂質沉積和血管內皮生長因子B表達的影響[J]. 張靚,馬謹,高海寧,李靈杰.  中國運動醫(yī)學雜志. 2017(09)



本文編號：3097229