發(fā)布時(shí)間：2021-03-24 06:20

　　目的使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子b（Vascular endothelial growth factor b,Vegfb）敲除斑馬魚模型。方法設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9位點(diǎn),體外轉(zhuǎn)錄單鏈向?qū)NA（single guide RNA,sg RNA）和Cas9 RNA,通過斑馬魚受精卵顯微注射,評(píng)價(jià)sg RNA效率。對(duì)子代斑馬魚進(jìn)行基因測(cè)序并篩選,最后獲得基因敲除的純合子斑馬魚Vegf-b-/-。結(jié)果針對(duì)1個(gè)基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了2個(gè)sg RNA,選擇效率最高的sg RNA1進(jìn)行斑馬魚受精卵顯微注射,獲得嵌合體F0代胚胎,篩選出穩(wěn)定遺傳的founder。并進(jìn)一步通過三代篩選鑒定獲得可穩(wěn)定遺傳的Vegf-b敲除的斑馬魚系,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其血管發(fā)育和心臟形態(tài)異常。結(jié)論通過CRISPR/Cas9技術(shù),可以穩(wěn)定可靠的構(gòu)建Vegf-b基因敲除斑馬魚,并證明Vegf-b影響斑馬魚體節(jié)間血管的發(fā)育和心臟功能,為后續(xù)Vegf-b功能研究奠定了重要的基礎(chǔ)。 

【文章來源】：廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,36(02)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

基因敲除斑馬魚模型的構(gòu)建過程

測(cè)序結(jié)果顯示，sg RNA1(圖2 A)出現(xiàn)明顯的套峰，且重疊峰出現(xiàn)在Vegf-b靶位點(diǎn)(黑色線框所標(biāo)注的序列)酶切位點(diǎn)附近，而sgRNA2為單峰(圖2B)，確定sg RNA1誘導(dǎo)突變有效，因此，本研究使用sgRNA1進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。3.2 Vegf-b敲除斑馬魚的構(gòu)建及篩選

F0代嵌合體成年后與同品系的野生型雜交，胚胎通過堿裂法測(cè)序，不能穩(wěn)定遺傳的F0代只有單峰，可以穩(wěn)定遺傳的有明顯套峰，稱之為founder(圖3 A)。讓founder與野生型雜交獲得F1代，待F1代成年后用堿裂法測(cè)序，沒有基因突變的野生型只有單峰，有基因突變的斑馬魚雜合子Vegf-b+/-有明顯套峰(圖3 B)。對(duì)F1代敲除雜合子進(jìn)行基因克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其基因序列缺失TC 2 bp堿基(圖3 C)。讓缺失TC 2 bp的F1代雜合子和野生型雜交獲得F2代，待F2代成年后用相同方法篩選出基因型相同的F2代敲除雜合子，野生型只有單峰，F(xiàn)2代敲除雜合子有明顯套峰(圖3 D)。讓F2代敲除雜合子Vegf-b+/-自交，相同的方法進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)雜合子Vegf-b+/-有明顯套峰，沒有基因突變的野生型或者有基因突變的純合子Vegf-b-/-(圖3 E)只有單峰，進(jìn)一步通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，野生型堿基沒有缺失，純合子Vegf-b-/-缺失TC 2 bp堿基(圖3 F)。最終獲得可穩(wěn)定遺傳的Vegf-b敲除的斑馬魚系。3.3 斑馬魚胚胎心血管發(fā)育評(píng)價(jià)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]模式生物斑馬魚在聽覺領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 劉可春,高燕,張?jiān)?何秋霞,韓利文,李寧,季秀娜,孫晨.  山東科學(xué). 2019(05)
[2]跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠比目魚肌脂質(zhì)沉積和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B表達(dá)的影響[J]. 張靚,馬謹(jǐn),高海寧,李靈杰.  中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志. 2017(09)



本文編號(hào)：3097229