目的改良原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。方法選取4～6周齡SD大鼠6只,經(jīng)開顱取腦、漂洗剪碎、過篩、牛血清白蛋白密度梯度離心、Ⅱ型膠原酶及膠原酶-分散酶兩次連續(xù)酶消化后進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和第Ⅷ因子免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定所培養(yǎng)的目的細(xì)胞。結(jié)果體外培養(yǎng)12～24 h后,細(xì)胞以貼壁的腦微血管段為中心,放射狀向外周移行,并逐漸擴(kuò)大成團(tuán)簇狀;細(xì)胞融合后則呈典型的單層、扁平、"鋪路石樣"鑲嵌式排列。第Ⅷ因子免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測,胞質(zhì)呈棕紅色,表達(dá)為陽性,陽性細(xì)胞率達(dá)99%以上。結(jié)論改良方法能夠成功高效分離培養(yǎng)出原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。 

【文章來源】：解剖學(xué)報. 2020,51(01)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

島嶼狀細(xì)胞團(tuán)簇逐漸融合形成鋪路石樣排列A～E．標(biāo)尺示100μm;F．標(biāo)尺示200μm

圖2 島嶼狀細(xì)胞團(tuán)簇逐漸融合形成鋪路石樣排列A～E．標(biāo)尺示100μm;F．標(biāo)尺示200μm接種足夠數(shù)量的腦微血管段，是發(fā)揮細(xì)胞群體優(yōu)勢、保證大鼠BMECs成活的關(guān)鍵。我們認(rèn)為，在100倍光學(xué)顯微鏡視野下，微血管段的接種數(shù)量應(yīng)達(dá)到20～30根為宜。為了獲得該數(shù)量的腦微血管段，課題組將實(shí)驗(yàn)大鼠的樣本數(shù)量從常規(guī)的2～4只，增加到了6只及以上。同時，針對化學(xué)酶消化法這一解離和培養(yǎng)原代大鼠BMECs的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，我們還對酶法的運(yùn)用、酶類的選擇以及作用時間等進(jìn)行了反復(fù)實(shí)踐和探索。如在酶法的運(yùn)用上，聯(lián)合選用了Ⅱ型膠原酶和膠原酶-分散酶作為主要消化酶，采用連續(xù)消化方法。這完全不同于鹿文葆[5]、查雨鋒[6,7]等運(yùn)用單一的Ⅱ型膠原酶或膠原酶-分散酶進(jìn)行消化，其優(yōu)點(diǎn)在于消化作用徹底，縮短了消化時間，節(jié)約了昂貴的膠原酶-分散酶，同時還達(dá)到了保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，提高接種存活率，分散雜細(xì)胞的目的。此外，由于膠原酶對BMECs的消化作用特點(diǎn)是由血管外層向里層逐步推進(jìn)，最后消化剩余的細(xì)胞才是內(nèi)皮細(xì)胞，故充分消化腦微血管段是獲得足夠數(shù)量BMECs的前提[8]。即消化液的量以每只大鼠腦1～2 ml為宜，常用工作濃度為0.1%或0.2%[9]。作用時間以倒置相差顯微鏡下觀察到短棍狀的微血管段被消化成串珠樣或桑葚樣改變時為準(zhǔn)。

BMECs是開展探索腦發(fā)育、認(rèn)知腦功能、構(gòu)建血腦屏障模型、預(yù)防腦卒中、康復(fù)腦功能、延緩腦動脈粥樣硬化、護(hù)腦延緩衰老等研究的重要載體，是運(yùn)用價值較大的研究腦生理、病理的工具細(xì)胞。課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[4]，圍繞如何增加大鼠腦微血管段的接種數(shù)量以及提高BMECs的活性質(zhì)量問題，對受試動物的選擇、微血管段的獲得以及酶消化法的運(yùn)用等進(jìn)行了積極改良和實(shí)踐。圖2 島嶼狀細(xì)胞團(tuán)簇逐漸融合形成鋪路石樣排列A～E．標(biāo)尺示100μm;F．標(biāo)尺示200μm

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定[J]. 馬華根,唐元瑜,紀(jì)立金.  解剖學(xué)雜志. 2018(03)
[2]小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J]. 宋曉彬,范春娥,王燁,張藝騰,崔叢叢,曾衛(wèi)衛(wèi),鄭麗蓉,蔡曉潔,陳華群.  南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版). 2017(03)
[3]一種高純度和高活力的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取及原代培養(yǎng)方法[J]. 查雨鋒,張順,蘇航,劉亭,傅曉鐘,董永喜,王愛民,王永林.  中國藥理學(xué)通報. 2014(11)
[4]大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定[J]. 鹿文葆,秦偉偉,劉淑英,李宏偉,修瑞娟.  中國腦血管病雜志. 2011(10)
[5]大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及不同純化方法的比較[J]. 田林郁,李勝富,周東.  四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2010(05)
[6]大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定[J]. 郭洋,伊鵬霏,呂釗君,白慧云,韋旭斌,杜紹范,穆祥.  沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2010(02)
[7]微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 婁晉寧.  微循環(huán)學(xué)雜志. 2004(03)
[8]牛脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定[J]. 詹永樂,李維業(yè).  解剖學(xué)報. 1997(03)



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