目的構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候選疫苗株并鑒定,初步評價其免疫原性。方法從GenBank中獲取M. tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列優(yōu)化后合成,經(jīng)PCR、酶切、連接與真核表達(dá)載體PVAX1重組,構(gòu)建重組質(zhì)粒PVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6。重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染驗證其表達(dá)后,免疫C57BL/6小鼠,檢測特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)果 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在體內(nèi)外均能表達(dá),Western blot結(jié)果顯示,DNA疫苗株體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24 h可檢測到特異性蛋白條帶,48 h蛋白表達(dá)量達(dá)最高。小鼠體內(nèi)實驗表明,Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng),可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生分泌高水平TNF-α的Th型免疫應(yīng)答,且Hsp65-Ag85B優(yōu)于Hsp65-ESAT6。結(jié)論 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有較強(qiáng)的免疫原性,呈Th型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,推測Hsp65-... 

【文章來源】：免疫學(xué)雜志. 2020,36(02)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的Western blot圖譜

免疫后小鼠血清TNF-α的ELISA檢測結(jié)果

目前免疫原性的檢測與疫苗保護(hù)效率是結(jié)核疫苗的評價的主要方法，而TNF-α是需要關(guān)注的重要指標(biāo)之一，是Mtb刺激機(jī)體產(chǎn)生一系列復(fù)雜的抗結(jié)核免疫相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子間的相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)控因子。它作為Th1型反應(yīng)的促進(jìn)因子通過活化巨噬細(xì)胞和促進(jìn)結(jié)核性肉芽腫形成發(fā)揮抗菌作用，還可以調(diào)節(jié)Mtb感染引起過強(qiáng)的Th1型反應(yīng)，減輕組織損傷。分泌性蛋白是Mtb生長過程中分泌到胞外的一類蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的保護(hù)性最好的一組抗原蛋白，對Mtb的防治具有重要意義，能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，對結(jié)核的感染發(fā)揮免疫保護(hù)作用。ESAT6是一種早期分泌性蛋白，由結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)的ORF編碼，在結(jié)核感染早期，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要作用，具有良好的免疫記憶能力，僅存在于致病性分枝桿菌中，在BCG菌株缺失。Ag85B作為另一種在BCG菌株中缺失的重要早期分泌性蛋白，具有較強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫活性。Hsp65是結(jié)核菌在休眠期的重要蛋白，可刺激巨噬細(xì)胞吞噬中性粒細(xì)胞，促進(jìn)其分泌抗菌酶類或識別其他病原相關(guān)分子模式以引起效應(yīng)機(jī)能，直接增強(qiáng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的活性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡從而起到殺菌作用。研究顯示，在Ag85B-HspX融合DNA疫苗免疫小鼠體內(nèi)TNF-α的含量顯著升高。袁偉等人對結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因疫苗在小鼠體內(nèi)的研究也證明了這一結(jié)論。本研究將結(jié)核菌缺失的早期分泌性蛋白ESAT6和Ag85B分別與休眠期蛋白Hsp65聯(lián)合，構(gòu)建于目前唯一公認(rèn)可以應(yīng)用于人體實驗的載體質(zhì)粒PVAX1，以期在結(jié)核感染早期和潛伏期均產(chǎn)生預(yù)防與治療作用。利用分子生物學(xué)的技術(shù)，我們通過基因合成，雙酶切，連接，成功構(gòu)建了PVAX1-Hsp65-Ag85B、PVAX1-Hsp65-ESAT6 DNA疫苗，并由菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳及測序鑒定了序列的正確性。通過對新型DNA疫苗的體外表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)DNA疫苗可在體外293T細(xì)胞中很好的轉(zhuǎn)錄、翻譯成免疫蛋白，并在48h時蛋白表達(dá)量達(dá)最高。由于C57BL/6小鼠可產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)主要用于研究結(jié)核的細(xì)胞免疫，本實驗將DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)DNA疫苗在免疫小鼠體內(nèi)激起了很好的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中與PBS組相比實驗組血清中細(xì)胞因子TNF-α的含量顯著升高，為進(jìn)一步追溯細(xì)胞因子TNF-α的來源，我們對實驗組脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞亞型進(jìn)行了流式分選，并對細(xì)胞因子TNF-α進(jìn)行了標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子TNF-α來源于Th1型和Th22型細(xì)胞，證明PVAX1-Hsp65-Ag85B、PVAX1-Hsp65-ESAT6 DNA疫苗主要通過激活Th型細(xì)胞分泌TNF-α對結(jié)核起作用，推測Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保護(hù)效力優(yōu)于Hsp65-ESAT6，還有待攻毒實驗驗證。此外，該DNA疫苗株與傳統(tǒng)結(jié)核BCG疫苗的免疫保護(hù)效果比較還有待于進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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