本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌抗原肽類表位對(duì)人外周γδT細(xì)胞特異性激活的探討，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:結(jié)核病(Tuberculosis,TB)的發(fā)生是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)和宿主免疫細(xì)胞相互作用的一個(gè)復(fù)雜過程。機(jī)體對(duì)Mtb感染的免疫機(jī)制和TB的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明。近年來,具有天然免疫樣作用的γδT細(xì)胞在Mtb感染中的免疫作用,已得到眾多研究者實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察的證實(shí)。然而,對(duì)γδT細(xì)胞所能識(shí)別抗原的研究多集中于磷酸類抗原,有關(guān)肽類表位的研究很少。但是,近期已有研究者報(bào)導(dǎo)γδT細(xì)胞識(shí)別人工合成多肽序列,本實(shí)驗(yàn)室近期經(jīng)噬菌體隨機(jī)多肽展示庫技術(shù)篩選獲得γδT細(xì)胞識(shí)別的多肽序列,其人工合成片段也可激活γδT細(xì)胞,證實(shí)了γδT細(xì)胞可以像B細(xì)胞一樣直接識(shí)別多肽表位。但γδT細(xì)胞是否也能識(shí)別B細(xì)胞所識(shí)別的表位,尚未見報(bào)道�；诖�,本研究應(yīng)用多肽表位人工合成片段體外刺激培養(yǎng)人外周PBMC后用流式細(xì)胞術(shù)分析Mtb-Ag中B細(xì)胞表位多肽能否特異性刺激γδT細(xì)胞的活化和增殖,以尋找更多的γδT細(xì)胞特異性表位多肽。也為抗Mtb感染的新型疫苗的研發(fā)提供一個(gè)新的方向。目的:探討Mtb抗原肽類表位能否特異性刺激γδT細(xì)胞。方法:1.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,選取Mtb蛋白抗原中的6條B細(xì)胞表位多肽序列;以及本實(shí)驗(yàn)室前期工作所得選取7條T細(xì)胞表位多肽序列,人工合成多肽片段。多肽人工合成片段采用PBS稀釋至1 mg/ml,過濾除菌后備用。2.將B細(xì)胞表位人工合成多肽片段包被在ELISA微孔板上,將健康人和結(jié)核患者血清,以不同稀釋度(1:3和1:9)加入微孔板中,加酶標(biāo)二抗(羊抗人Ig G-HRP),洗滌后,再加底物顯色,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔顯色的吸光度值(OD值),并與陰性孔對(duì)照和計(jì)算。3.將表位多肽作用于健康人PBMC,計(jì)算其刺激人外周血PBMC后,γδT細(xì)胞的增殖百分率;并利用CFSE染色技術(shù)觀察γδT細(xì)胞增殖代數(shù),檢測(cè)表位肽對(duì)γδT細(xì)胞的特異性活化增殖作用。4.收集各組培養(yǎng)的細(xì)胞,用熒光抗體進(jìn)行細(xì)胞表面抗原染色,包括CD3、TCRγδ、Vδ1、Vδ2,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),所得數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件分析。5.將表位多肽優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增出的γδT細(xì)胞,分兩份,每份分成三組,分別以等量對(duì)應(yīng)多肽、不加多肽和等量無關(guān)多肽,刺激18小時(shí)后收取一份通過表面抗原染色,檢測(cè)表達(dá)CD69細(xì)胞的百分率;另一份加入Mo(終濃度為1μg/ml)封閉4小時(shí)后,收取細(xì)胞先表面抗原染色后再細(xì)胞內(nèi)染色干擾素-γ(IFN-γ),檢測(cè)表達(dá)IFN-γ細(xì)胞的百分率。6.將表位多肽優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增出的γδT細(xì)胞,通過RT-PCR技術(shù)得到PCR產(chǎn)物經(jīng)過掃描,分析各自的優(yōu)勢(shì)峰分布特點(diǎn)。結(jié)果:1.ELISA結(jié)果顯示16例健康人和4例結(jié)核患者血清以1:3和1:9的稀釋度,加入包被B細(xì)胞表位多肽的微孔板。其OD值(OD450)大于陰性對(duì)照(cut off value,COV)2倍,均可與6條B細(xì)胞表位多肽結(jié)合�？梢宰C明從文獻(xiàn)中選取的6條多肽是B細(xì)胞表位多肽。2.人外周血PBMC經(jīng)Mtb-Ag B細(xì)胞表位6條多肽和T細(xì)胞表位7條多肽刺激培養(yǎng)12天后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析增殖細(xì)胞(CD3+、TCRγδ+)的百分率。用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)將各組與陰性對(duì)照進(jìn)行配對(duì)樣本比較,發(fā)現(xiàn)22例γδT細(xì)胞增殖百分率結(jié)果中BP2(5.8)、BP3(6.2)、BP4(6.3)、BP5(6.3)、TP13(5.4)、TP14(5.8)、TP15(5.6)、TP16(5.8)和Mtb-HAg(38.3)組與陰性對(duì)照(4.4)組比較明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.008、0.044、0.007、0.049、0.044、0.003、0.022、0.005和0.000)。3.CFSE標(biāo)記的PBMC經(jīng)上述表位多肽刺激培養(yǎng)12天后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析γδT細(xì)胞增殖(CD3+、TCRγδ+、CFSE-Low)的比例。用上述統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)7例γδT細(xì)胞增殖指數(shù)在BP2(3.9)、BP4(3.7)、BP5(4.2)、BP6(3.7)、TP14(3.7)、和TP15(3.8)組與陰性對(duì)照組(2.0)比較明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.018、0.018、0.028、0.028、0.018和0.018)。與此同時(shí),分析αβT細(xì)胞增殖(CD3+、TCRγδ-、CFSE-Low)的比例。用上述統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)7例αβT細(xì)胞增殖指數(shù)結(jié)果中各組統(tǒng)計(jì)差異無顯著性(P0.05)。4.人外周血PBMC經(jīng)上述表位多肽刺激培養(yǎng)12天后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析增殖細(xì)胞(CD3+、TCRγδ+、Vδ1+和CD3+、TCRγδ+、Vδ2+)的百分率。用上述統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)8例γδT細(xì)胞Vδ1亞群增殖百分率結(jié)果中BP1(5.8)、BP2(5.6)、BP3(5.4)、TP13(4.8)、TP15(5.4)、TP18(4.8)和TP23(7.1)組與陰性對(duì)照(3.4)組比較明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.05、0.05、0.05、0.036、0.036、0.036和0.036)。統(tǒng)計(jì)27例γδT細(xì)胞Vδ2亞群增殖百分率發(fā)現(xiàn)BP6(45.0)組與陰性對(duì)照(50.1)組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值為0.039,說明BP6非優(yōu)勢(shì)刺激Vδ2亞群。Mtb-HAg(84.8)組與陰性對(duì)照(50.1)組比較明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值為0.000)。5.表位多肽優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增出的γδT細(xì)胞,再刺激后發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)多肽刺激組比兩個(gè)對(duì)照組的表達(dá)CD69的細(xì)胞百分率和產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞百分率增高。6.表位肽優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增出的γδT細(xì)胞,通過RT-PCR技術(shù)和基因掃描分析,發(fā)現(xiàn)其TCR-Vδ-CDR3基因片段的分布呈寡克隆模式,而陽性對(duì)照Mtb-HAg擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的Vδ-CDR3基因片段呈多克隆分布模式。結(jié)論:1.來自Mtb抗原中的B細(xì)胞表位肽和γδTCR識(shí)別的肽片段均可激活γδT細(xì)胞增殖,但在不同個(gè)體間存在有差異。2.經(jīng)Mtb抗原的表位肽激活擴(kuò)增的γδT細(xì)胞被相同肽表位再刺激后,特異性活化分子CD69表達(dá)上調(diào),并誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)性細(xì)胞因子IFN-γ。3.經(jīng)Mtb抗原肽表位激活擴(kuò)增的γδT細(xì)胞,其TCRVδ-CDR3片段分布呈寡克隆性。4.Mtb抗原肽表位激活的γδT細(xì)胞具有克隆特異性。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 抗原 表位肽 B細(xì)胞 T細(xì)胞 γδT細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-24
• 結(jié)果24-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 致謝49-50
• 附錄A 英中文術(shù)語縮略語對(duì)照表50-52
• 附錄B 常用試劑配制52-54
• 附錄C 個(gè)人簡歷54-55
• 附錄D 綜述55-67
• 參考文獻(xiàn)62-67

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 ;Interleukin 17-Producing γδ T Cells Increased in Patients with Active Pulmonary Tuberculosis[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年03期

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3 何維;γδT細(xì)胞的抗原識(shí)別機(jī)制[J];中國免疫學(xué)雜志;1999年10期

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌抗原肽類表位對(duì)人外周γδT細(xì)胞特異性激活的探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：307442