發(fā)布時(shí)間：2017-04-15 02:15

  本文關(guān)鍵詞：維生素D減少RUPP模型大鼠蛋白尿的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:子癇前期是人類妊娠期特有的疾病,其發(fā)病率約占全部妊娠的2-8%。子癇前期的主要特征為水腫,高血壓,和蛋白尿。嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)生抽搐,昏迷等,是導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、新生兒窒息,甚至母嬰死亡的主要原因之一。子癇前期所引起的蛋白尿與腎小球的濾過屏障功能受損有著密不可分的關(guān)系。因此,我們有必要弄清子癇前期蛋白尿的發(fā)病機(jī)制,找到干預(yù)措施。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明,活性維生素D能通過抑制腎臟局部組織腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性,抑制腎素基因轉(zhuǎn)錄,減少糖尿病腎病患者蛋白尿。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明,活性維生素D類似物可以減輕糖尿病腎病大鼠系膜彌漫性增寬等病理改變,減少足細(xì)胞相關(guān)蛋白的缺失,減少糖尿病腎病大鼠蛋白尿�？紤]子癇前期孕婦血清中25(OH)D_3的水平下降,而維生素D缺乏的孕婦患子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)增加的事實(shí),我們假設(shè)活性維生素D能緩解子癇前期的蛋白尿現(xiàn)象。為了證實(shí)此假設(shè),本實(shí)驗(yàn)用公認(rèn)的子宮胎盤灌注壓下降(RUPP)模型大鼠模擬子癇前期表型,觀察活性維生素D對(duì)腎臟損傷及蛋白尿,以及足細(xì)胞相關(guān)分子的變化的影響,探討維生素D在子癇前期中的作用,為其用于緩解子癇前期蛋白尿提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。方法:1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以本實(shí)驗(yàn)室田曉瑜制備的三月齡SD孕大鼠的子宮胎盤灌注壓下降模型(RUPP)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將其分為單純?nèi)焉锝M(NP group)、RUPP手術(shù)組(RUPP group)、RUPP手術(shù)+1,25(OH)_2D組(RUPP+VD group)。2標(biāo)本收集和指標(biāo)測定孕18天時(shí),收集24小時(shí)尿液,孕19天時(shí),麻醉狀態(tài)下,頸動(dòng)脈取血4-5ml,取腎臟組織,分別用于尿蛋白,血清和組織中鈣的測定,組化/免疫組化和電鏡觀察,以及目的基因表達(dá)的測定。3全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter,AU5821,USA)測定尿蛋白,血鈣和組織鈣。4實(shí)時(shí)定量PCR檢測腎臟VDR,CYP24A1,nephrin,CD2AP,integrinβ1,podocin和α-actinin-4的mRNA表達(dá)。使用美國OMEGA公司總RNA提取試劑盒提取大鼠腎臟組織總RNA,以18S rRNA做內(nèi)參,實(shí)時(shí)定量PCR測定VDR,CYP24A1,nephrin,CD2AP,integrinβ1,podocin和α-actinin-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。5 PAS法檢測大鼠腎臟腎小球結(jié)構(gòu)對(duì)大鼠腎臟組織石蠟切片進(jìn)行PAS染色,檢測腎小球結(jié)構(gòu)變化情況。測量腎小球直徑,計(jì)數(shù)腎小球平均細(xì)胞核數(shù)。6透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察大鼠腎臟組織腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)的變化。7免疫組織化學(xué)分析腎臟組織PCNA、nephrin的蛋白水平對(duì)大鼠腎臟組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,分析PCNA、nephrin的蛋白水平。8 Western blot檢測腎臟VDR、PCNA和CD2AP的蛋白表達(dá)提取大鼠腎臟組織總蛋白,以β-actin為內(nèi)參,Western blot測定VDR、PCNA和CD2AP蛋白的相對(duì)表達(dá)量。9數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析,對(duì)所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),正態(tài)分布數(shù)據(jù)用x±SD表示,三組間比較用單因素方差(One-way ANOVA)分析,兩兩比較用SNK法。檢驗(yàn)以P0.05為差異有顯著性意義。結(jié)果:1補(bǔ)充1,25(OH)_2D可以增加RUPP大鼠的血鈣含量雖然大鼠腎皮質(zhì)中,三組鈣含量(NP=44.1±18.27,RUPP=44.9±21.66,RUPP+VD=38.44±11.21,μmol/mg pr.×100)并沒有顯著變化,但是RUPP+VD組的血清鈣水平(1.22±0.06 mmol/L),與NP組(1.08±0.06mmol/L,p0.01)和RUPP組(1.14±0.1 mmol/L,p0.05)相比,均有明顯的升高。表明,1,25(OH)_2D可以增加血清中的鈣含量,1,25(OH)_2D確實(shí)發(fā)揮了作用。2腎臟是1,25(OH)_2D的作用靶點(diǎn)2.1 RUPP鼠腎組織的維生素D受體(VDR)的mRNA(p0.001)和蛋白的表達(dá)比NP組明顯下降,但兩組蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組的mRNA(p0.001)和蛋白(p0.05)水平顯著升高。2.2 CYP24A1是VDR的下游基因。PCR結(jié)果顯示,RUPP+VD組腎組織CYP24A1 mRNA的表達(dá)較NP組(p0.001)和RUPP組(p0.05)均明顯升高。提示,1,25(OH)_2D確實(shí)是在腎臟中通過與VDR受體結(jié)合而來發(fā)揮作用。2.1和2.2的結(jié)果表明,腎臟是1,25(OH)_2D的作用靶點(diǎn)。3補(bǔ)充1,25(OH)_2D可以減少RUPP大鼠的蛋白尿RUPP組大鼠的尿蛋白(5.99±1.76 mg/24h)較NP組高(3.5±0.73mg/24h,p0.05);給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組的尿蛋白(3.71±1.38mg/24h)較RUPP組低(5.99±1.76 mg/24h,P0.01)。表明,補(bǔ)充1,25(OH)_2D可以緩解RUPP大鼠的蛋白尿。4補(bǔ)充1,25(OH)_2D可以改善RUPP大鼠腎小球的超微結(jié)構(gòu)4.1光鏡下PAS染色可見大鼠腎臟的腎小球,腎小囊以及腎小管等結(jié)構(gòu)。NP組大鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)正常,腎小球結(jié)構(gòu)完整,未見到腎小球的肥大,毛細(xì)血管袢開放良好,無細(xì)胞增多,基質(zhì)無明顯改變。與NP組相比,RUPP組和RUPP+VD組中以上結(jié)構(gòu)未見明顯變化,腎小球直徑和腎小球平均細(xì)胞核數(shù)均無明顯變化,表明1,25(OH)_2D未能改善腎小球結(jié)構(gòu)。4.2電鏡下可見大鼠腎小球?yàn)V過膜的三層結(jié)構(gòu):血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC,endothelial cells)、基底膜(bm,basement membrane)和足細(xì)胞足突(箭頭→,podocytic process)。與NP組相比,RUPP組腎小球的濾過膜結(jié)構(gòu)有所改變:大部分足突融合,基底膜增厚,隆起呈丘狀。而給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組的基底膜增厚和足細(xì)胞融合現(xiàn)象有所改善。說明,RUPP鼠的腎小球雖未出現(xiàn)明顯的病理改變,但腎小球?yàn)V過膜超微結(jié)構(gòu)有改變。因此1,25(OH)_2D降低RUPP鼠蛋白尿與其逆轉(zhuǎn)濾過膜結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。5補(bǔ)充1,25(OH)_2D可以降低RUPP大鼠中增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)Western和免疫組化(棕黃色顆粒)的結(jié)果顯示,作為增殖相關(guān)蛋白的PCNA在腎小球和腎小管中都有表達(dá),陽性顆粒定位于細(xì)胞核中。與NP組相比,其表達(dá)水平在RUPP組中有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組的PCNA的蛋白表達(dá)水平明顯下降(P0.01)。提示,1,25(OH)_2D降低了增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)。雖然上述4.2的結(jié)果未顯示各組大鼠的腎小球有增殖的跡象,但考慮到分子變化早于結(jié)構(gòu)的變化,我們認(rèn)為1,25(OH)_2D很可能還抑制了RUPP組大鼠腎組織的增殖,降低了蛋白尿。6 1,25(OH)_2D通過上調(diào)nephrin和CD2AP的表達(dá)來改善子癇前期產(chǎn)生的蛋白尿6.1 Nephrin是足細(xì)胞裂孔隔膜上的分子,參與構(gòu)成裂孔隔膜的拉鏈狀結(jié)構(gòu),對(duì)維持裂孔膜的完整性起著重要作用。與NP組大鼠相比,RUPP組大鼠的腎臟中nephrin的mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(棕黃染色淺)均明顯減弱(P0.001)。給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組的nephrin的mRNA表達(dá)(P0.001)和蛋白質(zhì)(棕黃染色加深,P0.05)表達(dá)水平均上調(diào)。6.2 CD2AP是使裂隙隔膜蛋白nephrin和podocin錨定于足細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。PCR和western的結(jié)果顯示,與NP組相比,RUPP組的CD2AP的mRNA(P0.01)和蛋白(P0.05)表達(dá)水平均顯著降低。與RUPP組相比,給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組CD2AP的mRNA(P0.001)和蛋白(P0.05)表達(dá)水平均顯著升高。6.1和6.2的結(jié)果表明,蛋白尿的發(fā)生與nephrin和CD2AP的表達(dá)減少有關(guān),1,25(OH)_2D可以上調(diào)nephrin和CD2AP的表達(dá)來降低RUPP大鼠的蛋白尿。6.3 integrinβ1是足細(xì)胞和基膜之間的重要黏附分子。PCR的結(jié)果顯示,與NP組相比,RUPP組大鼠腎臟integrinβ1 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P0.001)。給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組大鼠的integrinβ1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P0.001),但是integrinβ1的蛋白水平?jīng)]有變化(Western結(jié)果未列出)。說明,RUPP組大鼠蛋白尿的發(fā)生可能與integrinβ1的低轉(zhuǎn)錄水平有關(guān),但是1,25(OH)_2D并不影響腎integrinβ1基因的表達(dá)。6.4 Podocin是足細(xì)胞裂孔隔膜上的重要蛋白。PCR的結(jié)果顯示,與NP組相比,RUPP組大鼠腎臟podocin的mRNA表達(dá)顯著下降(P0.001),但是給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組大鼠的podocin mRNA的表達(dá)沒有明顯的改變。并且各組蛋白水平也沒有變化(結(jié)果未列出)。說明,RUPP組大鼠蛋白尿的發(fā)生可能與podocin的低轉(zhuǎn)錄水平有關(guān),但是1,25(OH)_2D并未影響腎podocin基因的表達(dá)。6.5 α-actinin-4是主要位于足細(xì)胞足突上的骨架肌動(dòng)蛋白。PCR結(jié)果顯示,與NP組相比,RUPP組大鼠腎臟α-actinin-4的mRNA表達(dá)顯著下降(P0.001),但是給予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD組大鼠α-actinin-4mRNA表達(dá)并未明顯升高。并且各組蛋白水平也沒有變化(結(jié)果未列出)。說明RUPP組大鼠蛋白尿的發(fā)生可能與α-actinin-4的低轉(zhuǎn)錄水平有關(guān),但是1,25(OH)_2D并不影響α-actinin-4基因的表達(dá)。結(jié)論:1 1,25(OH)_2D可以減少妊高癥大鼠的蛋白尿。2此作用與1,25(OH)_2D對(duì)大鼠腎臟的下列作用有關(guān):(1)1,25(OH)_2D逆轉(zhuǎn)了子癇前期大鼠腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)的改變。(2)1,25(OH)_2D上調(diào)了足細(xì)胞nephrin和CD2AP的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：維生素D 子癇前期 蛋白尿 足細(xì)胞 nephrin podocin
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R714.244;R-332
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-15
• 英文縮寫15-16
• 前言16-18
• 材料與方法18-30
• 結(jié)果30-33
• 附圖33-46
• 附表46-47
• 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 綜述 蛋白尿發(fā)生的相關(guān)分子及維生素D的改善作用54-71
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 致謝71-72
• 個(gè)人簡歷72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 LI XueZhu;HE John Cijiang;;An update: the role of Nephrin inside and outside the kidney[J];Science China(Life Sciences);2015年07期

  本文關(guān)鍵詞：維生素D減少RUPP模型大鼠蛋白尿的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：307384