本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力的標(biāo)準(zhǔn)化與量化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord Mensenchymal Stem Cell,hUC-MSCs)具有更強(qiáng)更穩(wěn)定的增殖分化能力,來源方便充足,對(duì)供者無傷害,病原微生物感染率低,安全性高。hUC-MSCs具有較高的免疫調(diào)控能力,是臨床治療血液疾病安全性高的異體干細(xì)胞。目前,傳統(tǒng)的MSCs培養(yǎng)體系中含有一定比例的動(dòng)物血清(Serum Containing Medium)成分,對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用造成安全隱患。本研究對(duì)比無血清與有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs增殖、衰老、細(xì)胞表面及全能標(biāo)志物、多向分化潛能,重點(diǎn)關(guān)注了兩個(gè)培養(yǎng)體系在免疫抑制方面的不同,探索培養(yǎng)hUC-MSCs的標(biāo)準(zhǔn)化方法,達(dá)到臨床的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。目的：驗(yàn)證不同個(gè)體臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的安全性以及免疫調(diào)節(jié)作用,安全的應(yīng)用于臨床治療。方法：(1)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外長期傳代以及衰老情況,測定生長曲線；長期傳代至終末期,采用Cellular Sencence Assay Kit檢測衰老相關(guān)的p半乳糖苷酶的活性；(2)流式檢測hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其細(xì)胞表面分子標(biāo)志以及全能標(biāo)志物的檢測；(3)對(duì)比hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其多向分化能力情況；(4)通過健康成人外周血激活期和靜止期的NK細(xì)胞分別與不同個(gè)體不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs共培養(yǎng),流式檢測IFN-y陽性的NK細(xì)胞的百分比,評(píng)價(jià)對(duì)固有免疫的調(diào)節(jié)作用；(5)通過BrdU酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)比兩個(gè)培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs對(duì) PBMC增值的抑制能力；(6)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)后免疫抑制能力,通過不同個(gè)體不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs和健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng),利用免疫酶聯(lián)試劑盒檢測上清中IFN-y的分泌水平,檢測上清中PGE2、IDO、IL-6的分泌,Real-time PCR檢測免疫相關(guān)因子TNF-beta、 IL-10、IL-27、Galectin-1、Galectin-3、IDO1、COX2、HGF及IL-6等mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：(1)無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs呈典型的長梭形貼壁細(xì)胞,與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs相比生長曲線較平緩,對(duì)數(shù)生長較晚,較早出現(xiàn)p半乳糖苷酶的活性；(2)無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均高表達(dá)CD29, CD44, CD73, CD90,CD105及CD106等間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記,不表達(dá)CD34,CD45,CD11b, CD19,HLA-DR,但是無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs全能標(biāo)志物Nanog, SOX2, Oct4, SSEA-4的陽性率更高；(3)無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有成脂成骨成軟骨分化能力；(4)兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs分別與激活期靜止期的NK細(xì)胞共培養(yǎng)16h后,流式檢測分泌IFN-y的NK細(xì)胞百分比均明顯減少,兩者沒有明顯差異,均對(duì)靜止期NK細(xì)胞的抑制能力更強(qiáng)；(5)無血清和有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs均抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖,均明顯抑制單個(gè)核細(xì)胞的IFN-y分泌,兩者PGE2、IDO、IL-6的分泌均沒有差異,無血清培養(yǎng)體系分泌的HGF明顯高于有血清培養(yǎng)體系；(6)mRNA水平上無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)的免疫相關(guān)因子TGF-beta1、IL-6、HGF高于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)的,但Galectin-1表達(dá)水平低于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)的。結(jié)論：(1)與傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)體系相比較,無血清培養(yǎng)體系體外增殖速度較慢、較早出現(xiàn)衰老；(2)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs在細(xì)胞表面以及多向分化等生物學(xué)特性相似,無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs具有更原始的狀態(tài)；(3)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力,且沒有差異性。背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞,在特定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種組織系統(tǒng)的細(xì)胞。此外,在造血、免疫、炎癥反應(yīng)、血管新生等人體重要功能中起調(diào)節(jié)作用,現(xiàn)在更多關(guān)注MSCs的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)分離自臍帶,涉及倫理問題較少相對(duì)更原始。MSC免疫抑制能力的最好例子是同種異體的MSC能有效治療重度移植物抗宿主病。體外研究表明,MSC能夠抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前對(duì)MSC免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還不完全清楚,但是越來越多研究表明其主要通過細(xì)胞間接觸如PD1-PD-L1,及可溶性因子如前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase, IDO)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)等發(fā)揮免疫抑制功能。hUC-MSC治療自身免疫系統(tǒng)疾病、移植物抗宿主病已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)研究階段進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)hUC-MSC有很好的應(yīng)用前景,但不同個(gè)體臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞免疫活性差別很大,目前缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法篩選出強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力的理想細(xì)胞。目的：驗(yàn)證不同個(gè)體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力具有穩(wěn)定的差異性,以人外周血單個(gè)核共培養(yǎng)體系作為檢測細(xì)胞生物學(xué)效力的方法不穩(wěn)定因素太多,所以我們需探尋定量檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫活性的方法,為臨床治療打下基礎(chǔ)。方法：(1)不同個(gè)體hUC-MSC和健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外共培養(yǎng),免疫酶聯(lián)試劑盒檢測上清IFN-y的分泌水平,反應(yīng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)活化后的外周血單個(gè)核細(xì)胞免疫抑制能力；(2)外源性炎癥因子刺激不同個(gè)體hUC-MSC在 mRNA水平上免疫相關(guān)因子的表達(dá)；(3)外源性炎癥因子刺激不同個(gè)體hUC-MSC,培養(yǎng)24小時(shí)后收集上清。酶聯(lián)免疫吸附法檢測間充質(zhì)干細(xì)胞PGE2、IDO、 Galectin-1、Galectin-3、TGF-beta1、HGF的分泌,驗(yàn)證蛋白分泌與免疫抑制能力的相關(guān)性；(4)吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)特異性抑制劑1-M-Trp、前列腺素E2(PGE2)合成抑制劑NS-398預(yù)處理,分別阻斷hUC-MSCs分泌PGE2、IDO,和健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng),檢測阻斷蛋白分泌后對(duì)hUC-MSCs免疫抑制效應(yīng)的影響。結(jié)果：(1)不同個(gè)體hUC-MSCs對(duì)IFN-y分泌的抑制能力有顯著性差異性穩(wěn)定存在,對(duì)IFN-y分泌的抑制率可反映個(gè)體hUC-MSC的免疫抑制能力；(2)炎癥因子刺激后IDO1、COX2、TGF-betal、Galectin-1、HGF、IL-6、Galectin-3等免疫相關(guān)因子mRNA明顯升高,IL-10、IL-27未見明顯變化。(3)比較不同個(gè)體hUC-MSC刺激后的因子分泌量與其抑制IFN分泌的抑制率的相關(guān)性,得出結(jié)論P(yáng)GE2具最高的相關(guān)性,IDO、IL-6次之。(4)阻斷IDO未逆轉(zhuǎn)hUC-MSC對(duì)于活化單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ抑制作用,但阻斷PGE2后,hUC-MSC對(duì)活化單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ抑制作用顯著降低,盡管未完全逆轉(zhuǎn),但說明了PGE2的關(guān)鍵性作用。結(jié)論：不同個(gè)體hUC-MSC的免疫抑制能力差異較大,我們1.5×10S/孔的hUC-MSCs接種于24孔板6小時(shí)貼壁后棄上清,在炎癥因子IFN-γ(5μg/ml)+TNF-α (1μg/ml)的刺激下培養(yǎng)24小時(shí),若PGE2分泌量409.89ng/ml,定為高免疫活性的hUC-MSC,臨床治療效果最優(yōu)。
【關(guān)鍵詞】：無血清培養(yǎng) 有血清培養(yǎng) hUC-MSCs 細(xì)胞增殖 免疫調(diào)節(jié) 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 PGE_2 IDO 免疫抑制 定量檢測
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 第一部分：標(biāo)準(zhǔn)化的無血清培養(yǎng)體系對(duì)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響4-35
• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8-9
• 材料與方法9-21
• 結(jié)果21-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 第二部分：定量評(píng)估不同個(gè)體人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力35-62
• 中文摘要35-37
• 英文摘要37-39
• 前言39-40
• 材料與方法40-51
• 結(jié)果51-58
• 討論58-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 附錄一 主要儀器材料及試劑62-65
• 附錄二 主要溶液的配置65-66
• 附錄三 常見英文縮寫和代碼66-67
• 附錄四 在學(xué)期間發(fā)表文章67-68
• 致謝68-69

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 史春夢(mèng);;間充質(zhì)干細(xì)胞表述中需要注意的幾個(gè)問題[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年14期

2 吳清法,王立生,吳祖澤;間充質(zhì)干細(xì)胞的來源及臨床應(yīng)用[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2002年03期

3 鄭春梅,孫昭,曹瑩,孫琪云,馬麗,馬冠杰,姜學(xué)英,趙春華;胎兒肺臟來源間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定與損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國生物工程雜志;2004年03期

4 余國建;間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨的研究[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);2004年S1期

5 宮立眾,田小波,鐘永明,夏順中;間充質(zhì)干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2004年11期

6 王蓓,汪維偉;間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊(cè);2005年06期

7 陳莉娜;王穎;張艷艷;關(guān)偉軍;;間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年28期

8 ;科技動(dòng)態(tài)[J];大眾科技;2008年03期

9 王瑛;李寧麗;;間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)趨化因子及受體的相關(guān)生物學(xué)功能[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2008年02期

10 金明順;張毅;賈秀芬;周燕華;閆妍;劉慧雯;;小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及多潛能分化的研究[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2009年04期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳可;王丁;韓之波;朱德林;韓忠朝;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外發(fā)揮免疫活性的研究[A];第12屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

2 金明順;張毅;賈秀芬;周燕華;閆妍;劉慧雯;;小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及多潛能分化的研究[A];中國解剖學(xué)會(huì)第十一屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2009年

3 李爭艷;劉楊;翟麗麗;楊迷玲;王立峰;;間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過程中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

4 張彥;李尚珠;;間充質(zhì)干細(xì)胞在血管工程中的機(jī)制及應(yīng)用[A];2009全國中西醫(yī)結(jié)合周圍血管疾病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2009年

5 石玉;戴\戎;;周期性拉應(yīng)力對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化影響的研究[A];第九屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

6 黎嬌;朱爭艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物對(duì)肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第30次學(xué)術(shù)年會(huì)暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

7 譚遠(yuǎn)超;Kevin;姜紅江;黃相杰;周紀(jì)平;;間充質(zhì)干細(xì)胞在骨傷疾病治療中的應(yīng)用[A];首屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨科微創(chuàng)學(xué)術(shù)交流會(huì)暨專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2011年

8 唐佩弦;;間充質(zhì)干細(xì)胞及其臨床應(yīng)用前景[A];第三屆全國血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

9 戴育成;;間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和應(yīng)用[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

10 胡琳莉;王昕榮;錢坤;李舟;楊薇;朱桂金;;小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)、中國動(dòng)物學(xué)會(huì)生殖生物學(xué)分會(huì)聯(lián)合年會(huì)論文匯編[C];2007年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 滿學(xué)杰;天津?yàn)I海新區(qū)建最大間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)基地[N];新華每日電訊;2008年

2 滿學(xué)杰;津昂賽打造間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)基地[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2008年

3 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;間充質(zhì)干細(xì)胞研究又見新方法[N];健康報(bào);2013年

4 上海生科院 上海交大醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 曹楷;間充質(zhì)干細(xì)胞：干細(xì)胞中的孫悟空[N];上�？萍紙�(bào);2014年

5 記者　陳建強(qiáng);首家間充質(zhì)干細(xì)胞庫在津建成[N];光明日?qǐng)?bào);2006年

6 記者　馮國梧;細(xì)胞產(chǎn)品國家工程中心建設(shè)方案獲準(zhǔn)[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

7 實(shí)習(xí)生 劉霞;間充質(zhì)干細(xì)胞有望用于面部整形[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

8 本報(bào)記者 王新佳;我國“原始間充質(zhì)干細(xì)胞”注射液進(jìn)入臨床研究[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2005年

9 馮國梧;全球首個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫規(guī)�；\(yùn)營[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

10 劉瑩清;全球首個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫泰達(dá)規(guī)模運(yùn)營[N];北方經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄭楚萍;功能化納米粒子對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響及細(xì)胞成像的應(yīng)用[D];暨南大學(xué);2015年

2 王皓;五指山小型豬OCT-4、SOX-2基因在骨髓間充質(zhì)與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的過表達(dá)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

3 孔德曉;間充質(zhì)干細(xì)胞及胰島素分泌細(xì)胞治療糖尿病的臨床及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];山東大學(xué);2015年

4 董苑;SDF-1復(fù)合PDPBB的構(gòu)建及對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞趨化影響的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王磊;誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2015年

6 房賀;連接黏附分子A在促進(jìn)MSC修復(fù)CC14肝損傷中的作用及其機(jī)制[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 李雪;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

8 陳可;人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

9 王靜;胎兒來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及間充質(zhì)干細(xì)胞在肝纖維化中治療機(jī)制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

10 鞠洪斌;大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化比較的體外研究[D];中南大學(xué);2006年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李超;小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中AC基因亞型的表達(dá)及AC3對(duì)其纖毛長度的影響[D];河北大學(xué);2015年

2 林濤;殼聚糖水凝膠復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 彭龍英;心肌營養(yǎng)素1促進(jìn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化存活及PI3K/Akt信號(hào)通路機(jī)制研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

4 喬曉慧;酸性環(huán)境對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

5 張紅霞;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定及其對(duì)人肺癌細(xì)胞惡性表型的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

6 顧立超;BTK抑制劑對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞miR-21的調(diào)節(jié)作用[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

7 王文杰;鴨胚間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及其移植修復(fù)肝損傷研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

8 張猛;血管內(nèi)皮前體細(xì)胞對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的影響[D];石河子大學(xué);2015年

9 馬麗媛;利用MyoD基因誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 宋維文;MicroRNA-133誘導(dǎo)綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力的標(biāo)準(zhǔn)化與量化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：308153