本文關鍵詞：人臍帶間充質干細胞的免疫調節(jié)能力的標準化與量化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：臍帶來源間充質干細胞(human Umbilical Cord Mensenchymal Stem Cell,hUC-MSCs)具有更強更穩(wěn)定的增殖分化能力,來源方便充足,對供者無傷害,病原微生物感染率低,安全性高。hUC-MSCs具有較高的免疫調控能力,是臨床治療血液疾病安全性高的異體干細胞。目前,傳統(tǒng)的MSCs培養(yǎng)體系中含有一定比例的動物血清(Serum Containing Medium)成分,對間充質干細胞的臨床應用造成安全隱患。本研究對比無血清與有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs增殖、衰老、細胞表面及全能標志物、多向分化潛能,重點關注了兩個培養(yǎng)體系在免疫抑制方面的不同,探索培養(yǎng)hUC-MSCs的標準化方法,達到臨床的應用標準。目的：驗證不同個體臍帶來源間充質干細胞在無血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的安全性以及免疫調節(jié)作用,安全的應用于臨床治療。方法：(1)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外長期傳代以及衰老情況,測定生長曲線；長期傳代至終末期,采用Cellular Sencence Assay Kit檢測衰老相關的p半乳糖苷酶的活性；(2)流式檢測hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其細胞表面分子標志以及全能標志物的檢測；(3)對比hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其多向分化能力情況；(4)通過健康成人外周血激活期和靜止期的NK細胞分別與不同個體不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs共培養(yǎng),流式檢測IFN-y陽性的NK細胞的百分比,評價對固有免疫的調節(jié)作用；(5)通過BrdU酶聯(lián)免疫吸附法對比兩個培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs對 PBMC增值的抑制能力；(6)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)后免疫抑制能力,通過不同個體不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs和健康成人外周血單個核細胞共培養(yǎng),利用免疫酶聯(lián)試劑盒檢測上清中IFN-y的分泌水平,檢測上清中PGE2、IDO、IL-6的分泌,Real-time PCR檢測免疫相關因子TNF-beta、 IL-10、IL-27、Galectin-1、Galectin-3、IDO1、COX2、HGF及IL-6等mRNA的表達水平。結果：(1)無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs呈典型的長梭形貼壁細胞,與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs相比生長曲線較平緩,對數(shù)生長較晚,較早出現(xiàn)p半乳糖苷酶的活性；(2)無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均高表達CD29, CD44, CD73, CD90,CD105及CD106等間充質干細胞的表面標記,不表達CD34,CD45,CD11b, CD19,HLA-DR,但是無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs全能標志物Nanog, SOX2, Oct4, SSEA-4的陽性率更高；(3)無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有成脂成骨成軟骨分化能力；(4)兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs分別與激活期靜止期的NK細胞共培養(yǎng)16h后,流式檢測分泌IFN-y的NK細胞百分比均明顯減少,兩者沒有明顯差異,均對靜止期NK細胞的抑制能力更強；(5)無血清和有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs均抑制外周血單個核細胞的增殖,均明顯抑制單個核細胞的IFN-y分泌,兩者PGE2、IDO、IL-6的分泌均沒有差異,無血清培養(yǎng)體系分泌的HGF明顯高于有血清培養(yǎng)體系；(6)mRNA水平上無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達的免疫相關因子TGF-beta1、IL-6、HGF高于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達的,但Galectin-1表達水平低于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達的。結論：(1)與傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)體系相比較,無血清培養(yǎng)體系體外增殖速度較慢、較早出現(xiàn)衰老；(2)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs在細胞表面以及多向分化等生物學特性相似,無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs具有更原始的狀態(tài)；(3)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有較強的免疫調節(jié)能力,且沒有差異性。背景：間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞,在特定條件下分化為神經(jīng)細胞、成骨細胞等多種組織系統(tǒng)的細胞。此外,在造血、免疫、炎癥反應、血管新生等人體重要功能中起調節(jié)作用,現(xiàn)在更多關注MSCs的低免疫原性和免疫調節(jié)能力。臍帶間充質干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)分離自臍帶,涉及倫理問題較少相對更原始。MSC免疫抑制能力的最好例子是同種異體的MSC能有效治療重度移植物抗宿主病。體外研究表明,MSC能夠抑制T細胞免疫反應。目前對MSC免疫調節(jié)機制還不完全清楚,但是越來越多研究表明其主要通過細胞間接觸如PD1-PD-L1,及可溶性因子如前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase, IDO)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)等發(fā)揮免疫抑制功能。hUC-MSC治療自身免疫系統(tǒng)疾病、移植物抗宿主病已經(jīng)由實驗研究階段進入臨床試驗階段,多項臨床試驗證實hUC-MSC有很好的應用前景,但不同個體臍帶來源間充質干細胞免疫活性差別很大,目前缺乏統(tǒng)一的標準方法篩選出強免疫調節(jié)能力的理想細胞。目的：驗證不同個體臍帶間充質干細胞免疫抑制能力具有穩(wěn)定的差異性,以人外周血單個核共培養(yǎng)體系作為檢測細胞生物學效力的方法不穩(wěn)定因素太多,所以我們需探尋定量檢測臍帶間充質干細胞免疫活性的方法,為臨床治療打下基礎。方法：(1)不同個體hUC-MSC和健康成人外周血單個核細胞體外共培養(yǎng),免疫酶聯(lián)試劑盒檢測上清IFN-y的分泌水平,反應人臍帶間充質干細胞對活化后的外周血單個核細胞免疫抑制能力；(2)外源性炎癥因子刺激不同個體hUC-MSC在 mRNA水平上免疫相關因子的表達；(3)外源性炎癥因子刺激不同個體hUC-MSC,培養(yǎng)24小時后收集上清。酶聯(lián)免疫吸附法檢測間充質干細胞PGE2、IDO、 Galectin-1、Galectin-3、TGF-beta1、HGF的分泌,驗證蛋白分泌與免疫抑制能力的相關性；(4)吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)特異性抑制劑1-M-Trp、前列腺素E2(PGE2)合成抑制劑NS-398預處理,分別阻斷hUC-MSCs分泌PGE2、IDO,和健康成人外周血單個核細胞共培養(yǎng),檢測阻斷蛋白分泌后對hUC-MSCs免疫抑制效應的影響。結果：(1)不同個體hUC-MSCs對IFN-y分泌的抑制能力有顯著性差異性穩(wěn)定存在,對IFN-y分泌的抑制率可反映個體hUC-MSC的免疫抑制能力；(2)炎癥因子刺激后IDO1、COX2、TGF-betal、Galectin-1、HGF、IL-6、Galectin-3等免疫相關因子mRNA明顯升高,IL-10、IL-27未見明顯變化。(3)比較不同個體hUC-MSC刺激后的因子分泌量與其抑制IFN分泌的抑制率的相關性,得出結論PGE2具最高的相關性,IDO、IL-6次之。(4)阻斷IDO未逆轉hUC-MSC對于活化單個核細胞IFN-γ抑制作用,但阻斷PGE2后,hUC-MSC對活化單個核細胞IFN-γ抑制作用顯著降低,盡管未完全逆轉,但說明了PGE2的關鍵性作用。結論：不同個體hUC-MSC的免疫抑制能力差異較大,我們1.5×10S/孔的hUC-MSCs接種于24孔板6小時貼壁后棄上清,在炎癥因子IFN-γ(5μg/ml)+TNF-α (1μg/ml)的刺激下培養(yǎng)24小時,若PGE2分泌量409.89ng/ml,定為高免疫活性的hUC-MSC,臨床治療效果最優(yōu)。
【關鍵詞】：無血清培養(yǎng) 有血清培養(yǎng) hUC-MSCs 細胞增殖 免疫調節(jié) 臍帶間充質干細胞 PGE_2 IDO 免疫抑制 定量檢測
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 第一部分：標準化的無血清培養(yǎng)體系對人臍帶來源間充質干細胞免疫調節(jié)活性的影響4-35
• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8-9
• 材料與方法9-21
• 結果21-30
• 討論30-32
• 結論32-33
• 參考文獻33-35
• 第二部分：定量評估不同個體人臍帶間充質干細胞的免疫調節(jié)能力35-62
• 中文摘要35-37
• 英文摘要37-39
• 前言39-40
• 材料與方法40-51
• 結果51-58
• 討論58-59
• 結論59-60
• 參考文獻60-62
• 附錄一 主要儀器材料及試劑62-65
• 附錄二 主要溶液的配置65-66
• 附錄三 常見英文縮寫和代碼66-67
• 附錄四 在學期間發(fā)表文章67-68
• 致謝68-69

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本文編號：308153