肌酐酶是用于臨床檢測腎小球?yàn)V過功能的關(guān)鍵酶之一,但目前國內(nèi)肌酐酶的生產(chǎn)量較低無法滿足市場需求,多依賴于國外進(jìn)口。為了解決這一問題,本研究將惡臭假單胞桿菌肌酐酶基因克隆至原核表達(dá)載體p MA5實(shí)現(xiàn)肌酐酶在枯草芽孢桿菌1A751中的異源表達(dá)。隨后通過啟動子優(yōu)化,使肌酐酶的蛋白表達(dá)量顯著提高到1.08mg/mL,并且胞外肌酐酶的比酶活力達(dá)到238U/mg。同時發(fā)現(xiàn)肌酐酶可不依賴于信號肽即可實(shí)現(xiàn)胞外分泌,因此對肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌機(jī)制進(jìn)行研究。通過對經(jīng)典分泌途徑和Holin途徑的分析排除、利用Calcein-AM/PI雙染色法鑒定表達(dá)菌株1AGC的細(xì)胞膜不完整,最后通過電子顯微鏡觀察結(jié)果表明表達(dá)菌株表面存在潛在的泄漏位點(diǎn),因此證實(shí)肌酐酶在枯草芽孢桿菌中通過細(xì)胞泄漏的方式,釋放到胞外培養(yǎng)基中。本文構(gòu)建了一株基于細(xì)胞泄漏的肌酐酶高產(chǎn)菌株,為肌酐酶的表達(dá)和潛在工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),同時也為枯草芽孢桿菌泄漏表達(dá)系統(tǒng)提供了一定的研究基礎(chǔ)。 

【文章來源】：化工進(jìn)展. 2020,39(04)北大核心

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

Holin蛋白驗(yàn)證分析結(jié)果

菌株1A751H和1AGC的染色結(jié)果

啟動子強(qiáng)度的不同，可以影響目的基因的轉(zhuǎn)錄程度，進(jìn)而影響外源蛋白在宿主菌株中的表達(dá)水平。為得到肌酐酶在枯草芽孢桿菌中合適的轉(zhuǎn)錄水平，通過組內(nèi)已有的蛋白研究，選用麥芽糖誘導(dǎo)型啟動子Pglv來代替pMA5的組成型啟動子PHpaⅡ[17]，從而構(gòu)建了麥芽糖誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pMGC。同時依靠組成型啟動子PhpaⅡ的重組肌酐酶表達(dá)質(zhì)粒pMA5-CR也進(jìn)行構(gòu)建。質(zhì)粒p MA5-CR和pMGC的驗(yàn)證結(jié)果見圖1，約在1200bp和1500bp處有明亮單一的條帶，與軟件預(yù)測的理論條帶大小一致。將驗(yàn)證正確的菌液接種于試管中培養(yǎng)12～14h，提取質(zhì)粒，送往金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用SnapGene軟件進(jìn)行分析比對，進(jìn)而獲得帶有肌酐酶目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-CR和pMGC。將質(zhì)粒p MA5-CR、pMGC和pMA5轉(zhuǎn)入B.subtilis 1A751進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)菌株1AHC、1AGC和對照菌株1A751H，搖瓶培養(yǎng)后的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖2。通過SnapGene軟件分析預(yù)測肌酐酶的理論蛋白分子量為30000，圖2中，可明顯觀測到菌株1AGC與1AHC在30000處存在條帶，與理論預(yù)測的蛋白分子量大小一致，同時可明顯觀察到麥芽糖誘導(dǎo)型菌株1AGC的表達(dá)量明顯高于組成型啟動子表達(dá)菌株1AHC。此外，從圖2(a)的搖瓶培養(yǎng)結(jié)果可分析出在24h時肌酐酶主要以胞內(nèi)可溶的形式存在逐步積累在細(xì)胞內(nèi)部。而從圖2(b)的結(jié)果來看，隨培養(yǎng)時間增加到48h時，胞外肌酐酶的蛋白量逐漸增加，胞內(nèi)可溶組分減少，這表明肌酐酶在枯草芽孢桿菌中不依賴于信號肽即可分泌到胞外培養(yǎng)基中。在通過啟動子優(yōu)化提高蛋白表達(dá)量的同時，出現(xiàn)少量錯誤折疊的蛋白即包涵體，很大程度是由于部分蛋白折疊中間體錯誤聚集形成的，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以考慮調(diào)節(jié)啟動子強(qiáng)度、降低培養(yǎng)溫度等手段進(jìn)行調(diào)節(jié)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]枯草芽胞桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)分泌系統(tǒng)發(fā)展及展望[J]. 張大偉,康倩.  微生物學(xué)雜志. 2019(01)
[2]hTNFR1在大腸桿菌中可溶性表達(dá)及純化[J]. 韓平,蓋園明,朱蓓薇,張大偉.  生物技術(shù)進(jìn)展. 2018(03)
[3]惡臭假單胞桿菌肌酐酶在大腸桿菌中的表達(dá)及其酶學(xué)特性分析[J]. 侯贛生,林影,梁書利.  現(xiàn)代食品科技. 2017(09)
[4]肌酐水解酶基因工程菌的構(gòu)建及功能研究[J]. 楊波,蔣芬,朱艷,楊成,向鐵勇,段紹斌,蔣云生.  中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志. 2016(05)
[5]雙乙酰-肌酸-CTMAB體系共振光散射法測定尿中痕量α-萘酚[J]. 袁康秀,袁玉坤,史林飛,周斌,王永生.  應(yīng)用化工. 2011(06)
[6]產(chǎn)肌酐水解酶基因工程菌的構(gòu)建[J]. 程新,張彥新,周桂鳳,蔣云生.  生物醫(yī)學(xué)工程研究. 2009(04)

碩士論文
[1]α-淀粉酶的異源表達(dá)、調(diào)控元件優(yōu)化和分泌瓶頸鑒定[D]. 陳景奇.天津大學(xué) 2015



本文編號：3071311