目的制備人艱難梭菌TcdB抗原表位抗體,建立針對人艱難梭菌TcdB雙抗體夾心ELISA檢測方法。方法通過生物信息學(xué)等方法預(yù)測人艱難梭菌TcdB蛋白的抗原表位,固相多肽合成法合成抗原并制備抗體Anti-TcdB1和Anti-TcdB2,ELISA檢測效價并驗證其特異性。用辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記TcdB2抗體,建立ELISA雙抗體夾心法。利用棋盤滴定法篩選一抗最佳包被濃度、最佳樣品稀釋倍數(shù)及最適二抗工作濃度等條件,優(yōu)化ELISA檢測方法并確定臨界值,用已知陽性、陰性標(biāo)本及重組B蛋白驗證該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性。結(jié)果間接ELISA確定Anti-TcdB1的效價為1∶512 000,抗TcdB2抗體為1∶2 048 000。棋盤滴定等方法確定ELISA一抗最佳包被濃度0.5μg/ml,樣品最佳稀釋倍數(shù)1∶2,酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶20 000。該診斷方法特異,不與其它腸道細(xì)菌感染出現(xiàn)交叉反應(yīng);重組B蛋白最低檢測限為32.25ng/ml;試驗的重復(fù)性良好,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%。結(jié)論本研究建立的檢測人艱難梭菌TcdB的ELISA... 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2020,15(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

Protean表位抗原預(yù)測結(jié)果

對結(jié)合protean(DNAstar）軟件分析TcdB全序列的親水性、表面可接觸性、彈性、抗原傾向性等條件分析（圖1），二級結(jié)構(gòu)預(yù)測其β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲為凸出結(jié)構(gòu)，暴露于蛋白質(zhì)抗原的可能性大，且利于抗原抗體嵌合，適合作為抗原表位�？乖瓫Q定簇進(jìn)行系統(tǒng)評價，確定以TcdB1 2085-2097(DGSKYYFDED-TAE),TcdB2 2308-2322(HQNTLDENFEGESIN）為表位抗原。通過SWISS-model的三級結(jié)構(gòu)建模（圖2）進(jìn)一步驗證抗原決定簇的優(yōu)劣性，可見其位于抗原表面，且具有較好的嵌合結(jié)構(gòu)，可作為抗原決定簇。2 Anti-TcdB1和Anti-TcdB2的效價

采用ELISA棋盤滴定法測定抗體Anti-TcdB1最適包被濃度和樣品最佳稀釋度結(jié)果見表3�？贵w最佳包被濃度為0.5μg/ml，樣品最佳稀釋倍數(shù)為1∶2，此時的S/N值最大為3.82。圖5 HRP-Anti-TcdB2最適工作濃度


本文編號：3072073