單細胞測序技術(shù)憑借其能全面反映細胞群體異質(zhì)性這一優(yōu)勢,近年來發(fā)展迅速.其中,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)提供了在分子水平上對細胞作分類或表征的替代方法,在發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液學(xué)、免疫及癌癥等研究領(lǐng)域均展示出了廣泛的應(yīng)用前景.本文總結(jié)了近年來單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的主要發(fā)展趨勢,并列舉了該技術(shù)在造血系統(tǒng)中的應(yīng)用. 

【文章來源】：中國科學(xué):生命科學(xué). 2020,50(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)操作流程(以Smart-seq為例).A:流式分選捕獲單細胞;B:模板切換法逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA;C:PCR擴增;D:文庫制備測序及數(shù)據(jù)分析

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在樣本的選擇上十分苛刻,一般取新鮮標本制成一定濃度的單細胞懸液,要求細胞活性高、黏連少,這就使得凍存樣本、輕微固定樣本、尸體標本以及難消化的組織塊等的應(yīng)用受限2013年,Grindberg等人[18]首次嘗試比較了小鼠的單個神經(jīng)細胞和單個細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄組的差異,發(fā)現(xiàn)二者檢出的基因表達差異相似.這就提示在處理復(fù)雜樣本時無需考慮胞質(zhì)損失帶來的問題,可直接分離單個細胞核及核內(nèi)mRNA來體現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài).此外,胞質(zhì)內(nèi)核糖體的去除還能減少組織解離后假基因的表達2016年,Aviv Regev實驗室和張峰實驗室[19]聯(lián)合推出Div-Seq,在已有單核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的基礎(chǔ)上優(yōu)化了聚類分析算法.2017年,他們再次發(fā)表“升級版”的DroNc-seq[20],改進了細胞核分離方法,不再依賴FACS(fluorescence activated cell sorting),實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量的測序以及實驗流程的進一步簡化.單核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)豐富了樣本的選擇,能夠滿足更多的臨床需求,如組織活檢、病理細胞圖譜繪制等.圖2 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)操作流程(以Smart-seq為例).A:流式分選捕獲單細胞;B:模板切換法逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA;C:PCR擴增;D:文庫制備測序及數(shù)據(jù)分析

隨著單細胞轉(zhuǎn)錄組測序通量的逐步提高,人們不再局限于對某個祖細胞分支或某類成熟細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜的探究,而是更為關(guān)注整個造血系統(tǒng)尤其是造血干/祖細胞的轉(zhuǎn)錄組特征.2015年,Kowalczyk等人[45]對8～12周齡小鼠和2歲左右衰老小鼠的長周期HSC、短周期HSC、多能祖細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序,評估造血干/祖細胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性以及其在穩(wěn)態(tài)造血中隨年齡的變化,即建立了造血干/祖細胞在穩(wěn)態(tài)下的正常及衰老圖譜.2016年,Nestorowa等人[40]將單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的樣本量擴大到1600余個造血干/祖細胞,建立了12個類群造血干/祖細胞的單細胞表達圖譜,為造血分化研究提供了較為系統(tǒng)的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)參考.劉兵實驗室[46,47]在造血發(fā)育方面的相關(guān)工作同樣以單細胞轉(zhuǎn)錄組測序為手段,分析小鼠胚胎主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros,AGM)區(qū)的內(nèi)皮細胞、pre-HSC和胎肝中的HSC,發(fā)現(xiàn)m TORC2信號通路以及H19長非編碼RNA在HSC早期形成階段中的關(guān)鍵作用,同時也補充了HSC在胚胎造血時期的單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜.近年來,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序搭配新的數(shù)據(jù)計算分析方法,能夠通過轉(zhuǎn)錄組的相似性將單細胞按照人為設(shè)定的分化時間點排列,從而虛擬重建細胞間關(guān)系.結(jié)合以上建立穩(wěn)態(tài)造血單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜的相關(guān)工作,越來越多的研究團隊提出造血分化是一個連續(xù)性的過程(圖3B),具體體現(xiàn)在低偏向未分化的造血干/祖細胞向譜系限制細胞的逐漸分化,以及分子水平上細胞分裂基因受抑和譜系特異性基因激活的統(tǒng)籌[44,48,49].這種假說強調(diào)造血干/祖細胞的異質(zhì)性,是對傳統(tǒng)造血分化模型的一大創(chuàng)新,但同時也存在與細胞表面標志的脫軌、過于依賴單細胞轉(zhuǎn)錄組測序等問題,還需要從表觀修飾等層面進行完善[50,51].

【參考文獻】：
期刊論文
[1]造血微環(huán)境研究進展與發(fā)展方向[J]. 程輝,程濤.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2017(12)
[2]造血干細胞功能異質(zhì)性研究的“金標準”——單細胞移植技術(shù)的建立和優(yōu)化[J]. 王曉芳,董芳,郝莎,程濤,Hideo Ema.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2017(12)
[3]造血干細胞異質(zhì)性[J]. 陳晨,郝莎,程濤.  中華血液學(xué)雜志. 2015 (10)



本文編號：3051104