本文關鍵詞：ETEC K88細胞適配體的篩選和快速檢測研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大腸桿菌(E.coli)引起的腹瀉在世界范圍內(nèi)成為了一個主要的公共衛(wèi)生問題。其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC K88)是一種最常見的引起腹瀉的致病菌。它易于通過食物攝取進入體內(nèi),極易使新生兒和斷奶仔豬的胃腸道發(fā)生感染。因此,建立一種新的快速靈敏檢測ETEC K88的方法是非常必要的。適配體(Aptamer)是ssDNA或者RNA,可以與靶標進行高親和力和高特異性的結(jié)合。目前適配體常用的篩選手段為指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)。其靶標包括金屬離子、有機小分子、藥物、甚至單分子蛋白質(zhì)和細胞。與傳統(tǒng)的抗體相比,它具有廉價、易合成和可修飾的優(yōu)點,被廣泛的應用于分子檢測、診斷治療和生物標記物發(fā)現(xiàn)等領域。石墨烯具有獨特的平面結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的導電、導熱性。氧化石墨烯(GO)是一種富氧基團(C/O≈2)的石墨烯,與石墨烯相比它極大的增強了親和性及水溶性。同時,作為一種高效的熒光淬滅劑,它能夠淬滅熒光體(上轉(zhuǎn)換納米材料、量子點及染料分子)的熒光,能穩(wěn)定的吸附ss DNA。近年來,利用GO優(yōu)良的特性,相繼開發(fā)了各種納米生物傳感器。本論文以ETEC K88為目標細菌,通過SELEX方法篩選出細胞適配體,并測定適配體與靶標之間的親和力和特異性;構(gòu)建了以細胞適配體為特異性探針,以GO為熒光淬滅劑的納米生物傳感器用于ETEC K88的快速檢測。具體實驗結(jié)果如下:一、采用CELL-SELEX技術(shù),通過11輪正篩選和4輪反篩選,獲得了一組富集度高、特異性強的適配體序列。經(jīng)純化和克隆,得到37個陽性克隆子。測序后進行一級同源性比對和二級結(jié)構(gòu)分析,可將它們分成三個家族。其中適配體A04的親和力最高(Kd=28 nmol)。后續(xù)實驗表明,ETEC K88與適配體A04的結(jié)合具有高特異性和靈敏性。二、利用GO納米熒光淬滅劑的特性以及Klenow fragment(KF)-輔助靶標循環(huán)放大的功能,構(gòu)建了一種新型的納米傳感器用于ETEC K88的快速檢測。該傳感器包括捕獲探針和信號探針。靶標加入前兩個探針形成了部分雙鏈結(jié)構(gòu)(PDSJ)并且吸附在石墨烯上,此時熒光淬滅。當加入靶標后,靶標與PDSJ形成了復合物,從而使PDSJ從GO上釋放出來,熒光得以恢復。隨后KF的加入引發(fā)了PDSJ的聚合反應,從而置換出靶標,置換出來的靶標能夠與其它的PDSJ結(jié)合,進入下一輪循環(huán)。靶標的循環(huán)利用使更多的PDSJ得以釋放,檢測的熒光信號顯著加強。實驗結(jié)果表明,在菌體濃度102~108CFU·m L-1范圍內(nèi),該傳感器具有高特異性和靈敏性,線性關系良好,相關系數(shù)R2=0.9907。其檢測下限達到了102 CFU·mL-1,比其他方法低10倍。
【關鍵詞】：適配體篩選 ETEC K88檢測 氧化石墨烯 Klenow fragment
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378.21;S852.612
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第1章 緒論12-25
• 1.1 大腸桿菌的危害、致病機理及檢測意義12-14
• 1.2 常見的大腸桿菌檢測方法的研究現(xiàn)狀及進展14-17
• 1.2.1 傳統(tǒng)方法14-15
• 1.2.2 分子生物學方法15-16
• 1.2.3 免疫學方法16-17
• 1.2.4 以生物傳感器為基礎的方法17
• 1.3 核酸適配體17-22
• 1.3.1 適配體篩選原理及流程17-20
• 1.3.2 適配體與靶標分子的結(jié)合原理20
• 1.3.3 適配體的特點20-21
• 1.3.4 適配體的應用及進展21-22
• 1.4 納米材料石墨烯22-23
• 1.4.1 石墨烯結(jié)構(gòu)及性質(zhì)22
• 1.4.2 石墨烯應用22-23
• 1.5 本論文的工作思路23-25
• 第2章 篩選ETEC K88細胞適配體25-39
• 2.1 引言25
• 2.2 實驗儀器試劑與材料25-28
• 2.2.1 主要實驗儀器25-26
• 2.2.2 菌株培養(yǎng)與預處理26
• 2.2.3 序列合成26-27
• 2.2.4 試劑和溶液27-28
• 2.3 實驗方法28-31
• 2.3.1 Cell-SELEX過程28-30
• 2.3.2 次級文庫結(jié)合率測定30
• 2.3.3 克隆和測序30
• 2.3.4 序列比對和分析30
• 2.3.5 適配體親和力的測定30-31
• 2.3.6 靈敏性實驗31
• 2.3.7 特異性實驗31
• 2.4 實驗結(jié)果與分析31-38
• 2.4.1 SELEX篩選條件的優(yōu)化31-32
• 2.4.2 次級文庫與ETEC K88結(jié)合率測定32-33
• 2.4.3 序列比對和分析33-35
• 2.4.4 親和力分析35-37
• 2.4.5 靈敏性測定37
• 2.4.6 特異性分析37-38
• 2.5 小結(jié)與討論38-39
• 第3章 基于氧化石墨烯納米淬滅劑和Klenow fragment引發(fā)靶標循環(huán)放大的納米生物傳感器在ETEC K88檢測中的應用39-53
• 3.1 引言39
• 3.2 納米生物傳感器的工作原理39-40
• 3.3 實驗儀器及試劑40-42
• 3.3.1 實驗儀器40-41
• 3.3.2 實驗試劑41-42
• 3.4 實驗方法42-44
• 3.4.1 氧化石墨烯的預處理42
• 3.4.2 體系可行性熒光分析42
• 3.4.3 體系可行性電泳分析42-43
• 3.4.4 體系工作條件優(yōu)化43
• 3.4.5 體系靈敏性檢測43
• 3.4.6 體系特異性檢測43-44
• 3.4.7 體系用于糞便樣本中ETEC K88檢測44
• 3.5 實驗結(jié)果與討論44-51
• 3.5.1 體系機制熒光分析44-45
• 3.5.2 體系機制電泳分析45-46
• 3.5.3 體系工作條件優(yōu)化結(jié)果與分析46-48
• 3.5.4 體系靈敏性檢測結(jié)果48-49
• 3.5.5 體系特異性檢測結(jié)果49-50
• 3.5.6 糞便樣本中ETEC K88檢測結(jié)果50-51
• 3.6 小結(jié)與討論51-53
• 第4章 結(jié)論與展望53-55
• 4.1 結(jié)論53-54
• 4.2 展望54-55
• 參考文獻55-63
• 攻讀碩士學位期間撰寫、發(fā)表的學術(shù)論文63-64
• 致謝64-66
• 附錄66

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 凌敏;ETEC K88細胞適配體的篩選和快速檢測研究[D];湖南師范大學;2015年

  本文關鍵詞：ETEC K88細胞適配體的篩選和快速檢測研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304307