本文關(guān)鍵詞：ETEC K88細(xì)胞適配體的篩選和快速檢測(cè)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大腸桿菌(E.coli)引起的腹瀉在世界范圍內(nèi)成為了一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC K88)是一種最常見(jiàn)的引起腹瀉的致病菌。它易于通過(guò)食物攝取進(jìn)入體內(nèi),極易使新生兒和斷奶仔豬的胃腸道發(fā)生感染。因此,建立一種新的快速靈敏檢測(cè)ETEC K88的方法是非常必要的。適配體(Aptamer)是ssDNA或者RNA,可以與靶標(biāo)進(jìn)行高親和力和高特異性的結(jié)合。目前適配體常用的篩選手段為指數(shù)級(jí)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)。其靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、藥物、甚至單分子蛋白質(zhì)和細(xì)胞。與傳統(tǒng)的抗體相比,它具有廉價(jià)、易合成和可修飾的優(yōu)點(diǎn),被廣泛的應(yīng)用于分子檢測(cè)、診斷治療和生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域。石墨烯具有獨(dú)特的平面結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的導(dǎo)電、導(dǎo)熱性。氧化石墨烯(GO)是一種富氧基團(tuán)(C/O≈2)的石墨烯,與石墨烯相比它極大的增強(qiáng)了親和性及水溶性。同時(shí),作為一種高效的熒光淬滅劑,它能夠淬滅熒光體(上轉(zhuǎn)換納米材料、量子點(diǎn)及染料分子)的熒光,能穩(wěn)定的吸附ss DNA。近年來(lái),利用GO優(yōu)良的特性,相繼開(kāi)發(fā)了各種納米生物傳感器。本論文以ETEC K88為目標(biāo)細(xì)菌,通過(guò)SELEX方法篩選出細(xì)胞適配體,并測(cè)定適配體與靶標(biāo)之間的親和力和特異性;構(gòu)建了以細(xì)胞適配體為特異性探針,以GO為熒光淬滅劑的納米生物傳感器用于ETEC K88的快速檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:一、采用CELL-SELEX技術(shù),通過(guò)11輪正篩選和4輪反篩選,獲得了一組富集度高、特異性強(qiáng)的適配體序列。經(jīng)純化和克隆,得到37個(gè)陽(yáng)性克隆子。測(cè)序后進(jìn)行一級(jí)同源性比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,可將它們分成三個(gè)家族。其中適配體A04的親和力最高(Kd=28 nmol)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明,ETEC K88與適配體A04的結(jié)合具有高特異性和靈敏性。二、利用GO納米熒光淬滅劑的特性以及Klenow fragment(KF)-輔助靶標(biāo)循環(huán)放大的功能,構(gòu)建了一種新型的納米傳感器用于ETEC K88的快速檢測(cè)。該傳感器包括捕獲探針和信號(hào)探針。靶標(biāo)加入前兩個(gè)探針形成了部分雙鏈結(jié)構(gòu)(PDSJ)并且吸附在石墨烯上,此時(shí)熒光淬滅。當(dāng)加入靶標(biāo)后,靶標(biāo)與PDSJ形成了復(fù)合物,從而使PDSJ從GO上釋放出來(lái),熒光得以恢復(fù)。隨后KF的加入引發(fā)了PDSJ的聚合反應(yīng),從而置換出靶標(biāo),置換出來(lái)的靶標(biāo)能夠與其它的PDSJ結(jié)合,進(jìn)入下一輪循環(huán)。靶標(biāo)的循環(huán)利用使更多的PDSJ得以釋放,檢測(cè)的熒光信號(hào)顯著加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在菌體濃度102~108CFU·m L-1范圍內(nèi),該傳感器具有高特異性和靈敏性,線(xiàn)性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2=0.9907。其檢測(cè)下限達(dá)到了102 CFU·mL-1,比其他方法低10倍。
【關(guān)鍵詞】：適配體篩選 ETEC K88檢測(cè) 氧化石墨烯 Klenow fragment
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R378.21;S852.612
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第1章 緒論12-25
• 1.1 大腸桿菌的危害、致病機(jī)理及檢測(cè)意義12-14
• 1.2 常見(jiàn)的大腸桿菌檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展14-17
• 1.2.1 傳統(tǒng)方法14-15
• 1.2.2 分子生物學(xué)方法15-16
• 1.2.3 免疫學(xué)方法16-17
• 1.2.4 以生物傳感器為基礎(chǔ)的方法17
• 1.3 核酸適配體17-22
• 1.3.1 適配體篩選原理及流程17-20
• 1.3.2 適配體與靶標(biāo)分子的結(jié)合原理20
• 1.3.3 適配體的特點(diǎn)20-21
• 1.3.4 適配體的應(yīng)用及進(jìn)展21-22
• 1.4 納米材料石墨烯22-23
• 1.4.1 石墨烯結(jié)構(gòu)及性質(zhì)22
• 1.4.2 石墨烯應(yīng)用22-23
• 1.5 本論文的工作思路23-25
• 第2章 篩選ETEC K88細(xì)胞適配體25-39
• 2.1 引言25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器試劑與材料25-28
• 2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.2.2 菌株培養(yǎng)與預(yù)處理26
• 2.2.3 序列合成26-27
• 2.2.4 試劑和溶液27-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2.3.1 Cell-SELEX過(guò)程28-30
• 2.3.2 次級(jí)文庫(kù)結(jié)合率測(cè)定30
• 2.3.3 克隆和測(cè)序30
• 2.3.4 序列比對(duì)和分析30
• 2.3.5 適配體親和力的測(cè)定30-31
• 2.3.6 靈敏性實(shí)驗(yàn)31
• 2.3.7 特異性實(shí)驗(yàn)31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析31-38
• 2.4.1 SELEX篩選條件的優(yōu)化31-32
• 2.4.2 次級(jí)文庫(kù)與ETEC K88結(jié)合率測(cè)定32-33
• 2.4.3 序列比對(duì)和分析33-35
• 2.4.4 親和力分析35-37
• 2.4.5 靈敏性測(cè)定37
• 2.4.6 特異性分析37-38
• 2.5 小結(jié)與討論38-39
• 第3章 基于氧化石墨烯納米淬滅劑和Klenow fragment引發(fā)靶標(biāo)循環(huán)放大的納米生物傳感器在ETEC K88檢測(cè)中的應(yīng)用39-53
• 3.1 引言39
• 3.2 納米生物傳感器的工作原理39-40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑40-42
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器40-41
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑41-42
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法42-44
• 3.4.1 氧化石墨烯的預(yù)處理42
• 3.4.2 體系可行性熒光分析42
• 3.4.3 體系可行性電泳分析42-43
• 3.4.4 體系工作條件優(yōu)化43
• 3.4.5 體系靈敏性檢測(cè)43
• 3.4.6 體系特異性檢測(cè)43-44
• 3.4.7 體系用于糞便樣本中ETEC K88檢測(cè)44
• 3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論44-51
• 3.5.1 體系機(jī)制熒光分析44-45
• 3.5.2 體系機(jī)制電泳分析45-46
• 3.5.3 體系工作條件優(yōu)化結(jié)果與分析46-48
• 3.5.4 體系靈敏性檢測(cè)結(jié)果48-49
• 3.5.5 體系特異性檢測(cè)結(jié)果49-50
• 3.5.6 糞便樣本中ETEC K88檢測(cè)結(jié)果50-51
• 3.6 小結(jié)與討論51-53
• 第4章 結(jié)論與展望53-55
• 4.1 結(jié)論53-54
• 4.2 展望54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫(xiě)、發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63-64
• 致謝64-66
• 附錄66

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 凌敏;ETEC K88細(xì)胞適配體的篩選和快速檢測(cè)研究[D];湖南師范大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：ETEC K88細(xì)胞適配體的篩選和快速檢測(cè)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：304307