目的制備人乳頭瘤病毒（HPV）16型E6原核表達(dá)蛋白及其多克隆抗體。方法通過PCR法從Siha細(xì)胞株中獲取HPV16 E6基因后克隆至pET21a（+）載體,構(gòu)建pET21a（+）/HPV16 E6重組質(zhì)粒,并經(jīng)測序鑒定;將重組質(zhì)粒pET21a（+）/HPV16 E6轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中,通過異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)HPV16 E6-His標(biāo)簽融合蛋白,經(jīng)鎳柱親和層析純化,然后通過Western blot法鑒定;將純化的HPV16型E6重組蛋白免疫日本大耳白兔制備多克隆抗體, ELISA檢測免疫后血清多克隆抗體效價,并用Western blot法和免疫熒光技術(shù)分析HPV16 E6兔多克隆抗體的特異性。結(jié)果成功構(gòu)建pET21a（+）/HPV16 E6重組質(zhì)粒,并經(jīng)測序鑒定;在重組質(zhì)粒pET21a（+）/HPV16 E6轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）后,經(jīng)親和層析法獲得純化的HPV16型E6重組蛋白,用于免疫日本大耳白兔獲得多克隆抗體,抗體效價為1∶40 000,并用Western blot法和免疫熒光技術(shù)確認(rèn)了多克隆抗體的特異性。結(jié)論... 

【文章來源】：細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2020,36(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將測序正確的重組質(zhì)粒pET21a(+)/HPV16 E6轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3)菌株中。經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá), SDS-PAGE分離后, 可見Mr 14 000處出現(xiàn)較濃的誘導(dǎo)條帶, 與理論值大小一致(圖3A)。超聲裂解后進(jìn)行SDS-PAGE分析, 發(fā)現(xiàn)重組蛋白在沉淀中, 以包涵體形式表達(dá)(圖3B)。通過6 mol/L鹽酸胍溶解, Ni-NTA親和層析純化, 在Mr 14 000 處出現(xiàn)明顯單一的蛋白條帶(圖3C)。以小鼠抗 His-tag mAb為一抗(1∶5000)進(jìn)行Western blot法分析, 在Mr 14 000處可見陽性單一反應(yīng)條帶(圖3D)。2.3 兔抗HPV16 E6抗體效價為1∶40 000

純化重組蛋白HPV16 E6透析復(fù)性后, 以10 μg/mL終濃度包被酶標(biāo)板, 間接 ELISA 法檢測兔0、 2、 4、 6、 8周抗HPV16 E6兔血清特異性IgG型抗體。結(jié)果顯示, HPV16E重組蛋白免疫后第2周開始產(chǎn)生特異性抗體, 至第8周達(dá)到高峰(圖4A) 。取8周血清進(jìn)行抗體稀釋滴度檢測, 結(jié)果顯示, HPV16 E6兔多克隆抗體的血清效價可達(dá)1∶40 000(圖4B)。2.4 制備的HPV16 E6兔多克隆抗體可特異性識別純化的HPV16 E6重組蛋白

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3025094