本研究旨在利用微生物體內(nèi)合成肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)多糖結(jié)合疫苗并研究其保護(hù)效果。通過敲除Kp O抗原連接酶基因waaL阻斷其LPS合成,再向缺失株中導(dǎo)入糖基工程載體,使細(xì)菌能夠在體內(nèi)合成糖蛋白,并將該糖蛋白免疫小鼠后評(píng)價(jià)其保護(hù)效果。結(jié)果表明,在構(gòu)建的KpwaaL缺失株中導(dǎo)入糖基工程載體后,底物蛋白重組霍亂毒素B亞單位rCTB (Recombinant cholera toxin B subunit)能夠被O糖化,從而得到糖蛋白;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該疫苗能刺激小鼠產(chǎn)生較高的抗體效價(jià),試驗(yàn)組小鼠攻毒后一周存活率可達(dá)75%。這種生物合成方法制備的多糖結(jié)合疫苗有望成為針對肺炎克雷伯氏菌的新型候選疫苗。 

【文章來源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020年09期 北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

Kp355 waa L基因缺失株的構(gòu)建及鑒定

通過對表達(dá)Kp355 O抗原糖蛋白工程菌的大量培養(yǎng)和發(fā)酵純化，得到了純度較高的糖蛋白。由于底物蛋白r CTB帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，通過鎳柱親和層析進(jìn)行第一步純化，可用低濃度咪唑溶液A1洗脫雜蛋白，高濃度咪唑溶液B1洗脫目的蛋白；再根據(jù)目的蛋白與雜蛋白分子大小的差異將樣品通過凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，以盡可能地除去雜蛋白。圖3A為將樣品注射入分子排阻色譜柱后，OD280值隨流經(jīng)色譜柱緩沖液體積的變化，箭頭所示為樣品收集峰，約為上樣后80 m L處。通過考馬斯亮藍(lán)染色檢測糖蛋白樣品(圖3B)可以看出，純化得到的C-OPSKp糖蛋白純度較高，樣品中幾乎沒有雜蛋白，說明鎳柱親和層析以及凝膠過濾層析兩步足以去掉絕大多數(shù)雜蛋白。經(jīng)計(jì)算每升LB培養(yǎng)基得到的糖蛋白中糖含量約為120μg左右。2.4 Kp355 LD50測定與疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)

隨后，我們通過糖蛋白疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的抗體效價(jià)、抗體亞型效價(jià)以及攻毒后不同佐劑組小鼠一周存活率的差異，來探究該疫苗的保護(hù)效果[11]。如圖4A–E所示，各組小鼠血清抗體效價(jià)以10為底做對數(shù)變換后的結(jié)果為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為不同試驗(yàn)組以及PBS組，試驗(yàn)組的總體Ig G抗體效價(jià)均與PBS組差異明顯，無佐劑組、角鯊烯佐劑組以及Poly(I:C)佐劑組的抗體效價(jià)均高于鋁佐劑組；按照上述Kp355兩倍半數(shù)致死劑量腹腔攻擊小鼠，結(jié)果如圖4F所示，同總體Ig G抗體效價(jià)測定結(jié)果一致，無佐劑組、角鯊烯佐劑組以及Poly(I:C)佐劑組小鼠的存活率均可達(dá)75%，與PBS組差異明顯，表明本研究制備的糖蛋白疫苗能夠保護(hù)小鼠免于Kp355致死劑量的攻擊。圖4 C-OPSKp的保護(hù)效果


本文編號(hào)：2928766