目的利用成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeat（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9（Cas9）]基因編輯技術構建抑制素基因敲除小鼠模型,并對其表型進行初步分析。方法根據(jù)抑制素α亞基的第一外顯子堿基序列,設計單鏈向導RNA（single guide RNA,sgRNA）識別序列,構建sgRNA表達質粒。利用T7 RNA聚合酶體外轉錄sgRNA和Cas9 mRNA后,將sgRNA/Cas9 mRNA顯微注射入C57BL/6J小鼠的受精卵,通過PCR和基因測序法檢測新生小鼠抑制素α亞基的基因堿基突變情況。選取F2代基因敲除純合子的雄鼠和雌鼠,分別取雄鼠睪丸和雌鼠卵巢進行觀察,并進行石蠟切片和HE染色分析。結果共獲得了12只F0代抑制素基因敲除小鼠,選取8號雄鼠與C57BL/6J雌鼠回交,得到F1代小鼠,再相互交配得到F2代小鼠。F2代小鼠各基因型比例符合孟德爾定律,基因敲除小鼠不存在胚胎致死現(xiàn)象。F2代純合子小鼠睪丸和卵巢發(fā)生癌變且無法生育... 

【文章來源】：實驗動物與比較醫(yī)學. 2020年04期

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

抑制素基因敲除靶向sgRNA的設計

Aug.2020,40(4)實驗動物與比較醫(yī)學LaboratoryAnimalandComparativeMedicine309M是DNAMarker，1～12是12只抑制素基因敲除后的F0代小鼠。NC是野生型小鼠C57BL/6J，作為對照。圖212只F0代小鼠抑制素基因的PCR后電泳結果Figure2ElectrophoreticresultsofinhibingeneinF0miceafterPCRM123456789101112NC代雜合子小鼠，然后F1代雜合子小鼠自交后產(chǎn)生F2代小鼠，抑制素基因鑒定結果見圖3A。統(tǒng)計173只F2代野生型、雜合子和基因敲除純合子3種基因型小鼠的存活個體數(shù)量，分別為45、93和35只，占全部F2代小鼠的26.0%、53.7%和20.2%，約為1∶2∶1，符合孟德爾分離定律，說明抑制素基因敲除小鼠不存在胚胎致死表型。F2代野生型、雜合子和基因敲除純合子3種基因型小鼠于90日齡的平均體質量比較見圖3B，與野生型小鼠相比，雜合子小鼠體質量無明顯差異（P＞0.05），而抑制素基因敲除純合子小鼠的體質量明顯減輕（P＜0.05）。2.4抑制素基因敲除小鼠的生殖器官大體觀察將F2代抑制素基因敲除雄鼠與雌鼠交配，結果不育。將抑制素α基因敲除雌鼠與C57BL/6J雄鼠交配，仍然不育。觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2代及后續(xù)子代中抑制素α基因敲除雄鼠分籠飼養(yǎng)后，肉眼可見睪丸會逐漸增大。將抑制素基因敲除雄鼠和雌鼠解剖后觀察其生殖系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)雄鼠的生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，睪丸變大，顏色發(fā)黑，內有血液，附睪萎縮或被吸收入睪丸組織（圖4A）；雌鼠的生殖系統(tǒng)同樣發(fā)育異常，卵巢變大，顏色發(fā)黑，輸卵管已萎縮或被吸收入卵巢組織，子宮粗大，內部充滿液體（圖4B）。表1F0代小鼠抑制素基因的TA克隆測序結果Table1TAcloningandgenesequencingresultsofinhibingeneinF0mice小鼠編號抑制素基因敲除區(qū)域長度/bp判定178910CCCGAACTTGTCCGGGAG-GGACCTCTGAACC

310實驗動物與比較醫(yī)學LaboratoryAnimalandComparativeMedicineAug.2020,40(4)ABA為雄鼠睪丸組織，B為雌鼠卵巢；KO、HET和WT分別代表F2代小鼠的基因敲除純合子、雜合子和野生型3種基因型。圖4抑制素基因敲除小鼠的生殖器官觀察Figure4Reproductiveorgansofinhibingeneknockoutmice(A,malemousetestis;B,femalemouseovary)體質量/gNC為C57BL/6J小鼠對照。KO、HET和WT分別代表F2代小鼠的基因敲除純合子、雜合子和野生型3種基因型。**與野生型小鼠相比，P＜0.05。圖3F2代小鼠的抑制素α基因PCR鑒定（A）和體質量比較（B）Figure3ElectrophoreticresultsofPCRproductsofinhibinαgene(A)andbodyweightofF2mice(B)B3種不同基因型小鼠OHETKWT3536373839404142434445464748495051NCA小鼠編號5253545556575859606162636465666768NC小鼠編號6970717273747576777879808182838485NC小鼠編號

【參考文獻】：
期刊論文
[1]抑制素基因免疫誘導單胎綿羊孿生的研究[J]. 張德坤,楊利國,張紅琳,王文,烏娜爾汗,紀平,古武昌.  中國農業(yè)大學學報. 2004(04)



本文編號：2914304