本文關(guān)鍵詞：胞紅蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]胞紅蛋白(cytoglobin,CYGB)是一種新發(fā)現(xiàn)的攜氧球蛋白,CYGB在神經(jīng)細(xì)胞缺氧時(shí)表達(dá)明顯增加并具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用。本文探討巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中CYGB表達(dá)模式;構(gòu)建CYGB過表達(dá)/低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型,研究CYGB在氧化應(yīng)激過程中對(duì)巨噬細(xì)胞的作用。[方法]1、將小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、人巨噬細(xì)胞株THP-1、EC及人肝癌細(xì)胞Hep G2擴(kuò)增后,Western blot檢測(cè)正常生理狀態(tài)下RAW264.7、THP-1、EC及Hep G2細(xì)胞中CYGB蛋白的表達(dá)水平。2、將小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7擴(kuò)增后,Western blot檢測(cè)RAW264.7在H2O2刺激不同時(shí)間時(shí)CYGB的蛋白表達(dá)水平:分為4組:對(duì)照組,0.5mmol/L H2O2處理6、12、24 h組。Western blot檢測(cè)RAW264.7在不同濃度H2O2刺激12h時(shí)CYGB蛋白的表達(dá)水平:分為4組:對(duì)照組,0.25mmol/L H2O2、0.5mmol/L H2O2、1mmol/L H2O2處理組。3、首先構(gòu)建CYGB過表達(dá)/低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型。然后觀察在氧化應(yīng)激過程中CYGB對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的作用,將RAW264.7細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、0.5mmol/L H2O2處理組、0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達(dá)組及0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組。于12h后,檢測(cè)CYGB蛋白水平、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、乳酸脫氫(LDH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD);熒光定量PCR檢測(cè)CYGB、NF-κB在細(xì)胞中的表達(dá)。[結(jié)果]1、Western blot結(jié)果顯示:在正常生理狀態(tài)下,CYGB在小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、人巨噬細(xì)胞株THP-1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EC及人肝癌細(xì)胞Hep G2中均有表達(dá)。2、Western blot結(jié)果顯示:H2O2處理6、12、24 h組CYGB表達(dá)水平高于對(duì)照組,并且在12h組CYGB表達(dá)水平最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。0.25mmol/L H2O2、0.5mmol/L H2O2和1mmol/L H2O2處理巨噬細(xì)胞12h后CYGB表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、熒光顯微鏡結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染CYGB過表達(dá)質(zhì)粒及CYGB低表達(dá)質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見綠色熒光。4、Western blot結(jié)果顯示:0.5mmol/L H2O2處理組、0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達(dá)組及0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組CYGB蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達(dá)組的CYGB表達(dá)最高(P0.05),0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組的CYGB表達(dá)較0.5mmol/L H2O2處理組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和ROS檢測(cè)結(jié)果顯示:與0.5mmol/L H2O2相比,0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達(dá)組中GSH-PX、SOD升高,LDH、MDA、ROS下降;與0.5mmol/L H2O2組相比,0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組中GSH-PX、SOD下降,LDH、MDA、ROS升高。熒光定量PCR檢測(cè)顯示:與正常對(duì)照組比較,H2O2處理組CYGB和NF-κB表達(dá)均上調(diào)(P0.05)。與H2O2對(duì)照組比較,CYGB過表達(dá)組CYGB表達(dá)較高,NF-κB表達(dá)較低(P0.05);CYGB低表達(dá)組CYGB表達(dá)較低,NF-κB表達(dá)較高(P0.05)。[結(jié)論]1.CYGB在巨噬細(xì)胞中表達(dá),在H2O2刺激時(shí)表達(dá)水平增加。2.CYGB在巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中具有細(xì)胞保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞 氧化應(yīng)激 胞紅蛋白 H2O2
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392.12
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-20
• 1.1 前言14-18
• 1.2 技術(shù)路線18-20
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1 細(xì)胞株20
• 2.2 主要試劑20
• 2.3 主要儀器20-21
• 2.4 數(shù)據(jù)處理和分析21-22
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法22-40
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 3.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇22
• 3.1.2 細(xì)胞傳代22-23
• 3.1.3 細(xì)胞凍存23
• 3.2 實(shí)驗(yàn)分組23-24
• 3.3 CYGB在各種細(xì)胞中的表達(dá)24-26
• 3.3.1 試劑配制24-25
• 3.3.2 蛋白提取25
• 3.3.3 蛋白定量25
• 3.3.4 SDS-PAGE電泳25-26
• 3.4 H_2O_2處理巨噬細(xì)對(duì)CYGB表達(dá)的影響26-27
• 3.4.1 H_2O_2處理RAW264.7 不同時(shí)間對(duì)CYGB表達(dá)的影響26-27
• 3.4.2 不同濃度H_2O_2處理RAW264.7 對(duì)CYGB表達(dá)的影響27
• 3.5 CYGB過表達(dá)和低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型的構(gòu)建和鑒定27-31
• 3.5.1 溶液的配制27-28
• 3.5.2 培養(yǎng)受體菌28
• 3.5.3 制備感受態(tài)細(xì)胞28
• 3.5.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化28
• 3.5.5 質(zhì)粒的提取28-30
• 3.5.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染30-31
• 3.6 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力的測(cè)定31-32
• 3.6.1 試劑組成及配制31
• 3.6.2 樣本的前處理31
• 3.6.3 細(xì)胞中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力測(cè)定操作表31-32
• 3.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)32-33
• 3.7.1 試劑組成與配制32-33
• 3.7.2 樣本的前處理33
• 3.7.3 細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)操作表33
• 3.8 乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)33-34
• 3.8.1 試劑組成及配制33-34
• 3.8.2 樣本的前處理34
• 3.8.3 培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)操作表34
• 3.9 丙二醛(MDA)活性檢測(cè)34-35
• 3.9.1 試劑的組成與配制34-35
• 3.9.2 樣品前處理35
• 3.9.3 細(xì)胞中丙二醛(MDA)活性檢測(cè)操作表35
• 3.10 活性氧(ROS)活性檢測(cè)35-36
• 3.10.1 試劑組成及保存35-36
• 3.10.2 操作步驟36
• 3.11 熒光定量PCR檢測(cè)CYGB、NF-κB在細(xì)胞中的表達(dá)36-40
• 3.11.1 溶液配制36
• 3.11.2 RNA提取36-37
• 3.11.3 RNA反轉(zhuǎn)錄37-38
• 3.11.4 熒光定量-PCR38-40
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-52
• 4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果40-41
• 4.2 CYGB在各種細(xì)胞中的表達(dá)41
• 4.3 H_2O_2處理RAW264.7 對(duì)CYGB表達(dá)的影響41-43
• 4.3.1 H_2O_2處理RAW264.7 不同時(shí)間對(duì)CYGB表達(dá)的影響41-42
• 4.3.2 不同濃度H_2O_2處理RAW264.7 對(duì)CYGB表達(dá)的影響42-43
• 4.4 CYGB過表達(dá)和低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型的構(gòu)建和鑒定43-45
• 4.5 CYGB對(duì)H_2O_2處理的巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用45-51
• 4.5.1 H_2O_2處理對(duì)RAW264.7 細(xì)胞CYGB表達(dá)的影響45-46
• 4.5.2 CYGB對(duì)RAW264.7 細(xì)胞GSH-PX活性影響46-47
• 4.5.3 CYGB對(duì)RAW264.7 細(xì)胞SOD活性影響47-48
• 4.5.4 CYGB對(duì)RAW264.7 細(xì)胞LDH活性影響48-49
• 4.5.5 CYGB對(duì)RAW264.7 細(xì)胞MDA活性影響49-50
• 4.5.6 CYGB對(duì)RAW264.7 細(xì)胞ROS活性影響50-51
• 4.6 熒光定量PCR檢測(cè)NF-κB在細(xì)胞中的表達(dá)51-52
• 第5章 討論52-56
• 第6章 結(jié)論56-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 文獻(xiàn)綜述62-72
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果72-74
• 致謝74-75
• 本研究基金資助項(xiàng)目75

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 張國(guó)陽(yáng);李道江;揭志剛;李正榮;;胃癌相關(guān)DNA甲基化的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年19期

2 徐中菊;張悅;舒適;李志杰;張瑞義;;胞紅蛋白研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年10期

3 紀(jì)莎;瑪依努爾·尼牙孜;;DNA甲基化與宮頸癌研究進(jìn)展[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2014年03期

4 李新敏;古雅麗;王香芝;郭華鋒;宮宏宇;;p16、DAPK和ESRβ基因啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌的關(guān)系[J];診斷病理學(xué)雜志;2015年02期

  本文關(guān)鍵詞：胞紅蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：288606