本文關(guān)鍵詞：加熱洗脫硝酸纖維膜上保存的尿蛋白質(zhì)及尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生物標(biāo)志物指的是與生理或病理生理過(guò)程相關(guān)的可監(jiān)測(cè)的變化,其本質(zhì)是變化。血漿作為機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分,受穩(wěn)態(tài)機(jī)制調(diào)節(jié)各種理化成分保持相對(duì)恒定：而尿液作為機(jī)體的代謝廢物,包含更多反映機(jī)體變化的信息,即尿液可能是比血液更好的挖掘生物標(biāo)志物的來(lái)源。尿液作為重要的生物樣本,將其與臨床病歷在疾病的每個(gè)階段一起保存下來(lái),那么在尋找生物標(biāo)志物的前瞻性研究中,特別是在大規(guī)模臨床驗(yàn)證試驗(yàn)中,將起到非常重要的作用。隨著用硝酸纖維膜保存尿蛋白質(zhì)方法的建立,將尿蛋白質(zhì)吸附在硝酸纖維膜上、干燥后真空保存,這使低成本、大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間保存尿液樣本成為可能。用硝酸纖維膜保存尿蛋白質(zhì)對(duì)于生物標(biāo)志物的研究意義重大,但是如何有效地從保存尿蛋白質(zhì)的膜上將蛋白質(zhì)洗脫下來(lái),直接決定著該保存方法的被接受程度和應(yīng)用范圍。然而現(xiàn)有的強(qiáng)烈渦旋洗脫方法需要將每一個(gè)樣品強(qiáng)烈渦旋至少10 min才能使硝酸纖維膜完全溶解、而且干燥蛋白質(zhì)沉淀時(shí)硝酸纖維膜易再次形成,這使洗脫過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低,從而束縛了用硝酸纖維膜保存尿蛋白的應(yīng)用。針對(duì)以上問(wèn)題本論文提出了加熱洗脫蛋白質(zhì)的方法：通過(guò)提高硝酸纖維膜溶解時(shí)的溫度,縮短了強(qiáng)烈渦旋時(shí)間、簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)洗脫步驟、有效防止了硝酸纖維膜的再形成,并且比強(qiáng)烈渦旋洗脫方法獲得更多的蛋白質(zhì)(P0.05), SDS-PAGE分析,加熱洗脫法并沒(méi)有讓蛋白質(zhì)發(fā)生降解。LC-MS/MS分析加熱洗脫方法和直接丙酮沉淀方法制備的蛋白質(zhì)樣品,質(zhì)譜所鑒定到蛋白質(zhì)重疊率無(wú)明顯差異(分別是92.6%,96.8%),蛋白質(zhì)豐度CV值20%的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例均很高(分別是85.2%,94.4%)。加熱洗脫法具有很好的技術(shù)重復(fù)性,操作更加高效、簡(jiǎn)單,有利于用膜保存尿蛋白質(zhì)方法的推廣應(yīng)用。蛋白質(zhì)翻譯后修飾能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能,從而在發(fā)育、代謝、疾病等眾多生物學(xué)過(guò)程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此,在翻譯后修飾層面尋找標(biāo)志物可能比單純?cè)诘鞍踪|(zhì)層面獲得更多信息。相對(duì)于已知的400多種翻譯后修飾,目前對(duì)尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的大規(guī)模研究依舊局限在磷酸化和糖基化的領(lǐng)域,我們對(duì)尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的認(rèn)識(shí)僅僅是冰山一角。本論文對(duì)尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)行了探索性研究,乙�；�、丙�；�、丁酰化、三甲基化、琥珀�；�、巴豆�；@幾個(gè)近幾年發(fā)現(xiàn)在機(jī)體生命活動(dòng)中起到重要調(diào)控作用的修飾,經(jīng)過(guò)Western Blot分析,結(jié)果顯示在正常人尿蛋白質(zhì)上均存在。為了進(jìn)一步探索在不同的腎臟疾病狀態(tài)下,這幾種翻譯后修飾上是否存在差異,我們對(duì)比了惡性高血壓腎臟損傷、膜性腎病、IgA腎病、狼瘡性腎炎、紫癜性腎病和正常人尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的差異。結(jié)果顯示,腎臟疾病狀態(tài)下,尿蛋白質(zhì)賴氨酸上的丙�；黠@增多、琥珀酰化幾乎消失。鑒于尿蛋白質(zhì)帶有某種修飾的蛋白僅是全尿蛋白質(zhì)組的一部分,通過(guò)富集手段來(lái)對(duì)其進(jìn)行研究,能夠減少樣品的復(fù)雜度。因此,從尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾作為切入點(diǎn)來(lái)尋找疾病標(biāo)志物,可能會(huì)為我們帶來(lái)更多的驚喜。
【關(guān)鍵詞】：尿蛋白質(zhì)保存 硝酸纖維膜 蛋白質(zhì)組學(xué) 生物樣本保存 疾病標(biāo)志物 翻譯后修飾 乙�；� 丙�；� 丁�；� 三甲基化 琥珀�；� 巴豆�；�
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 引言9-15
• 1.1 尿液是比血液更好的尋找生物標(biāo)志物的來(lái)源9-10
• 1.1.1 尿液作為尋找生物標(biāo)志物來(lái)源的優(yōu)點(diǎn)9
• 1.1.2 尿液作為尋找生物標(biāo)志物來(lái)源的缺點(diǎn)及應(yīng)對(duì)策略9-10
• 1.2 尿液樣本的保存10-11
• 1.2.1 傳統(tǒng)保存尿液樣本的方法的困境10
• 1.2.2 膜保存尿液樣本方法及蛋白質(zhì)洗脫方法的改良10-11
• 1.3. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾11-12
• 1.3.1 在蛋白質(zhì)翻譯后修飾層面尋找疾病標(biāo)志物志物11
• 1.3.2 尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的疾病標(biāo)志物11-12
• 1.4. 本論文的研究?jī)?nèi)容12-13
• 1.4.1 硝酸纖維膜上保存的尿蛋白質(zhì)洗脫方法的改良——加熱洗脫法12
• 1.4.2 尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究12-13
• 參考文獻(xiàn)13-15
• 第二章 材料和方法15-23
• 2.1 硝酸纖維膜上保存的尿蛋白質(zhì)洗脫方法的改良——加熱洗脫法15-20
• 2.1.1 材料15-16
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 2.2 尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的探索性研究20-22
• 2.2.1 材料20-21
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-22
• 參考文獻(xiàn)22-23
• 第三章 結(jié)果與討論23-37
• 3.1 硝酸纖維膜上保存的尿蛋白質(zhì)洗脫方法的改良——加熱洗脫法23-25
• 3.1.1 結(jié)果23-25
• 3.1.1.1 兩種洗脫方法得到的蛋白質(zhì)的量23
• 3.1.1.2 一維聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)23
• 3.1.1.3 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)重疊率23-24
• 3.1.1.4 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)豐度的變異系數(shù)24-25
• 3.1.2 討論25
• 3.2 尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的探索性研究25-37
• 3.2.1 結(jié)果25-36
• 3.2.1.1 健康組的人口學(xué)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果25-27
• 3.2.1.2 尿蛋白質(zhì)組賴氨酸乙�；揎�27-28
• 3.2.1.3 尿蛋白質(zhì)組賴氨酸丁�；揎�28-30
• 3.2.1.4 尿蛋白質(zhì)組賴氨酸琥珀�；揎�30-31
• 3.2.1.5 尿蛋白質(zhì)組賴氨酸丙�；揎�31-33
• 3.2.1.6 尿蛋白質(zhì)組賴氨酸巴豆�；揎�33-34
• 3.2.1.7 尿蛋白質(zhì)組賴氨酸三甲基化修飾34-36
• 3.2.2 討論36-37
• 體液中翻譯后修飾的研究進(jìn)展37-44
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 附表1 丙酮沉淀法提取尿蛋白質(zhì)樣本的鑒定情況44-68
• 附表2 加熱洗脫法提取尿蛋白質(zhì)樣本的鑒定情況68-82
• 附表3 正常人全尿蛋白SDS-PAGE分析和賴氨酸乙酰化修飾Western Blot分析82-83
• 附表4 正常人全尿蛋白SDS-PAGE分析和賴氨酸丙�；揎梂estern Blot分析83-84
• 附表5 正常人全尿蛋白SDS-PAGE分析和賴氨酸丁�；揎梂estern Blot分析84-85
• 附表6 正常人全尿蛋白SDS-PAGE分析和賴氨酸琥珀�；揎梂estern Blot分析85-86
• 附表7 正常人全尿蛋白SDS-PAGE分析和賴氨酸巴豆�；揎梂estern Blot分析86-87
• 附表8 正常人全尿蛋白SDS-PAGE分析和賴氨酸三甲基化化修飾Western Blot分析87-88
• 致謝88-90
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷90
• 在讀期間學(xué)術(shù)成果90-91

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 LI MengLin;ZHAO MinDi;GAO YouHe;;Changes of proteins induced by anticoagulants can be more sensitively detected in urine than in plasma[J];Science China(Life Sciences);2014年07期

  本文關(guān)鍵詞：加熱洗脫硝酸纖維膜上保存的尿蛋白質(zhì)及尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：288444