本文關(guān)鍵詞：WTH3多克隆抗體的制備及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景腫瘤的多藥耐藥性已經(jīng)成為當(dāng)今腫瘤治療主要的失敗原因,是腫瘤化療最主要的障礙。細(xì)胞耐藥機制因其所用的藥物種類以及腫瘤類型的不同而有所差異。不同類型的腫瘤對同種藥物的耐藥機制不同,并且同種腫瘤對同種藥物也有多種的耐藥機制。DNA甲基化是一種重要的遺傳修飾機制,其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤治療等方面有緊密的相關(guān)性,是常見的抑癌基因失活機制,甚至在某些特定的情況下單一的甲基化修飾就可以促使惡性腫瘤的形成。由于基因的轉(zhuǎn)錄受到DNA甲基化狀態(tài)下產(chǎn)生的特異性基因位點與啟動子結(jié)合的影響,因此在DNA甲基化狀態(tài)下產(chǎn)生基因序列的改變后會產(chǎn)生特定的甲基化序列結(jié)合蛋白進(jìn)而影響腫瘤的多藥耐藥。在進(jìn)一步研究DNA甲基化與腫瘤多藥耐藥性之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)了抗耐藥基因WTH3。研究發(fā)現(xiàn),耐藥細(xì)胞株與非耐藥細(xì)胞株相比,WTH3的甲基化水平顯著不同。之后對該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因是由254個氨基酸組成的G蛋白。由于WTH3的-COOH末端的半胱氨酸翻譯后缺少修飾,所以不能結(jié)合到細(xì)胞膜上,而大部分分布于細(xì)胞質(zhì)中,少部分在細(xì)胞核內(nèi)。相關(guān)資料表明,WTH3的參與細(xì)胞的MDR具有普遍性。為了進(jìn)一步研究WTH3的細(xì)胞生物學(xué)功能,我們急需制備出WTH3蛋白的特異性抗體。目前市場上還沒有作用較好的商品化抗人WTH3的抗體,因此我們著手制備了WTH3的抗體,為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。實驗方法本實驗首先利用RT-PCR驗證WTH3m RNA在SKOV3/SKOV3-DDP細(xì)胞系中存在表達(dá),之后利用電腦篩選基因全長中蛋白表達(dá)區(qū)域中外露的抗原決定簇,制備多肽片段,并與cys偶聯(lián)后作為抗原,與佐劑混合后免疫新西蘭白兔,達(dá)到免疫效價后,提取免疫后血清純化后得到多克隆抗體,并進(jìn)行ELISA,Western-Blot免疫印跡實驗、細(xì)胞免疫熒光實驗對該抗體進(jìn)行鑒定。實驗結(jié)果本實驗利用人工合成的多肽片段,免疫實驗用兔,第三次免疫后ELISA結(jié)果顯示所得多克隆抗體抗體效價較高,再次進(jìn)行加強免疫后,ELISA檢測抗體效價可達(dá)2.0×105U以上,可以用于實驗室檢測。利用所制備抗體進(jìn)行免疫印跡實驗時,制備抗體可以識別組織中WTH3蛋白,證明所得抗體可以用于實驗室Western-Blot檢測WTH3蛋白。實驗結(jié)論1.本實驗利用抗原免疫動物后,得到了效價較高的抗體。2.本實驗制備的WTH3抗體在Western-Blot免疫印跡實驗中能夠特異性檢測到WTH3蛋白。
【關(guān)鍵詞】：WTH3 多克隆抗體 DNA甲基化 抗體制備 MDR
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文縮略詞表8-12
• 第一章 緒論12-20
• 1.1 研究背景12-14
• 1.1.1 WTH312
• 1.1.2 甲基化及CpG島12-13
• 1.1.3 MDR13
• 1.1.4 甲基化與MDR的關(guān)系13-14
• 1.2 抗體14-15
• 1.2.1 抗體的分類14
• 1.2.2 多克隆抗體與單克隆抗體14
• 1.2.3 多克隆抗體與單克隆抗體比較14-15
• 1.3 抗體制備15-18
• 1.3.1 多克隆抗體制備15-16
• 1.3.2 單克隆抗體制備16-18
• 1.3.3 基因工程抗體制備18
• 1.4 抗體純化18-20
• 第二章 材料與方法20-34
• 2.1 實驗材料20-23
• 2.1.1 細(xì)胞系20
• 2.1.2 實驗動物20
• 2.1.3 主要儀器及設(shè)備20-21
• 2.1.4 主要試劑21
• 2.1.5 主要試劑配制21-23
• 2.2 實驗方法23-34
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)23-24
• 2.2.2 RT-PCR檢測WTH3mRNA表達(dá)24-26
• 2.2.3 抗體制備26-28
• 2.2.4 硫酸銨鹽析法抗體純化28-29
• 2.2.5 間接ELISA法檢測抗體效價29-30
• 2.2.6 Western Blot檢測WTH3蛋白表達(dá)30-32
• 2.2.7 免疫熒光32-34
• 第三章 實驗結(jié)果34-41
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 3.2 RT-PCR法檢測WTH3 MRNA的表達(dá)34-35
• 3.3 抗原肽段篩選及合成35-36
• 3.4 第三次免疫后抗體效價檢測36-37
• 3.5 純化后抗體效價37-39
• 3.6 WTH3的表達(dá)39-41
• 3.6.1 Westen-Blot免疫印跡39
• 3.6.2 細(xì)胞免疫熒光39-41
• 第四章 討論41-43
• 4.1 PCR檢測WTH3 MRNA表達(dá)41
• 4.2 抗人工合成多肽片段抗體制備41-42
• 4.3 抗體純化42
• 4.4 抗體鑒定42-43
• 第五章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 作者簡介50-51
• 致謝51

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