目的探討膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2, ANXA2)在登革病毒Ⅱ型(dengue virus typeⅡ, DENV-2)入胞過程中的作用。方法通過敲低ANXA2和S100鈣結(jié)合蛋白A10(S100A10)表達以及抗體阻斷實驗驗證ANXA2在DENV-2復制周期中的作用,并進一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察、免疫共沉淀分析明確ANXA2與DENV-2 E蛋白的相互作用。結(jié)果 DENV-2感染ANXA2和S100A10敲低的細胞中,DENV-2 RNA水平顯著降低;ANXA2抗體和DENV-2 E蛋白抗體可有效抑制DENV-2的入胞效率,細胞內(nèi)病毒RNA水平顯著低于對照組;此外,ANXA2在DENV-2感染細胞中由細胞質(zhì)募集到細胞膜上,與DENV-2 E蛋白有相互作用。結(jié)論 ANXA2是DENV-2入胞過程中重要的宿主分子,有望為抗DENV-2研究提供新的靶點。
【部分圖文】：

ANXA2是一種重要的鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，分子量約為38 kDa，參與細胞的多種生理生化活動，如胞膜運動、囊泡運輸、胞吞和胞吐作用等。在細胞受到刺激后，ANXA2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜，與S100A10形成異源四聚體[10]。本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察到DENV-2吸附至Huh-7細胞的過程中，可誘導細胞質(zhì)內(nèi)分布的ANXA2募集到細胞膜上，并且與DENV-2 E蛋白共定位，而S100A10是否在此過程中起作用還需繼續(xù)研究；免疫共沉淀實驗進一步明確了DENV-2 E蛋白與ANXA2和S100A10的相互作用。在之前的研究報道中，ANXA2參與了HPV-16和巨細胞病毒的內(nèi)吞過程，并且可增強病毒感染[13-14]。HPV-16在人角質(zhì)形成細胞中誘導ANXA2轉(zhuǎn)移到細胞膜外，從而作為受體分子結(jié)合HPV-16并介導病毒內(nèi)吞；在人巨細胞病毒感染過程中，病毒與ANXA2結(jié)合并增強了人巨細胞病毒的感染[15]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在感染HBV后的細胞中，細胞膜上ANXA2水平逐漸下降，可有效防止HBV的過度感染[16]。另有研究觀察到ANXA2在人胚橫紋肌瘤細胞表面的表達增強了EV71型的感染[17]。圖4 ANXA2、S100A10與DENV-2 E蛋白在細胞內(nèi)的相互作用

圖3 ANXA2與DENV-2 E蛋白在病毒入胞階段的共定位分析本研究中，低表達S100A10和ANXA2的細胞中，DENV-2 RNA的復制水平降低，提示S100A10和ANXA2對DENV-2的復制周期有顯著影響。抗體阻斷實驗中，以DENV-2 E蛋白抗體作為陽性對照、鼠IgG抗體作為陰性對照，ANXA2抗體可顯著抑制進入細胞的DENV-2，表明ANXA2在DENV-2入胞階段參與DENV-2的復制周期，是DENV-2感染起始過程中的重要宿主因子之一。因此，ANXA2在多種病毒包括DENV-2感染細胞的入胞過程中均起到重要的促進作用。除了參與病毒的入胞階段，ANXA2在HCV致病機制中也起著重要作用，可將病毒NS3/NS4A募集到脂筏微結(jié)構域，從而在Huh7.5細胞中啟動病毒復制復合物[18]。DENV-2與HCV具有相似的復制機制，ANXA2是否在DENV-2入胞后的復制階段調(diào)控病毒的翻譯和轉(zhuǎn)錄尚未見報道。此外，ANXA2促進DENV-2入胞是以單體形式還是與S100A10形成四聚體形式發(fā)揮功能還須深入研究。

基因敲低實驗結(jié)果顯示，3對針對ANXA2的shRNA中，與對照組相比，1號shRNA可抑制63.6%ANXA2 mRNA表達（t=6.222,P=0.003),2號shRNA可抑制77.8%ANXA2 mRNA表達（t=7.671,P=0.002),3號sh RNA無抑制效果（t=0.037,P=0.972）（見圖1A);3對針對S100A10的shRNA中，與對照組相比，1號shRNA無抑制效果（t=2.096,P=0.104),2號sh RNA可抑制85.1%S100A10m RNA表達（t=6.382,P=0.003),3號shRNA可抑制41.4%S100A10 mRNA表達（t=2.842,P=0.047）（見圖1 B);ANXA2敲低的細胞中，DENV-2 RNA水平為對照組的14.2%(t=14.860,P=0.000),S100A10敲低的細胞中，DENV-2RNA水平為對照組的44.7%(t=6.881,P=0.002）（見圖1 C）。2.2 ANXA2抗體可有效阻斷DENV-2感染Huh-7細胞
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