發(fā)布時(shí)間：2020-11-03 03:21

　　 背景:現(xiàn)有方法將外源分子如DNA導(dǎo)入到人胚胎干細(xì)胞用于科學(xué)研究的效率普遍較低,如何優(yōu)化現(xiàn)有條件,提高轉(zhuǎn)染效率顯得尤為重要。目的:比較兩種不同的傳代方法對(duì)人胚胎干細(xì)胞系H9轉(zhuǎn)染效率的影響,優(yōu)化胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件。方法:人胚胎干細(xì)胞系H9分別采用小克隆傳代法和單細(xì)胞傳代法進(jìn)行傳代,傳代后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h,用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染p AdTrack-AKT1熒光質(zhì)粒2 d后,熒光顯微鏡下觀察熒光質(zhì)粒的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率;RT-qPCR和Westernblot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后AKT1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論:①熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞傳代組表達(dá)熒光質(zhì)粒的細(xì)胞數(shù)量更多,流式細(xì)胞儀檢測(cè)單細(xì)胞傳代法的轉(zhuǎn)染效率[(47.18±2.00)%]高于小克隆傳代法的轉(zhuǎn)染效率[(19.52±0.86)%],差異有顯著性意義(P0.01);②單細(xì)胞傳代組轉(zhuǎn)染后AKT1 mRNA和蛋白的表達(dá)均高于小克隆傳代組,差異有顯著性意義(P 0.01);③結(jié)果表明,采用單細(xì)胞傳代法,增加細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體的接觸面積可提高人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
【部分圖文】：

妝澩鎪?劍?峁?礱韉ハ赴???ń檔拖?胞匯合度和細(xì)胞間的緊密程度可明顯提高人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度過(guò)小，脂質(zhì)體毒性作用明顯，細(xì)胞死亡增多，轉(zhuǎn)染效率亦不高。因此，轉(zhuǎn)染前優(yōu)化圖注：圖中A-C分別為培養(yǎng)第1，3，7天時(shí)的細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)7d時(shí)細(xì)胞匯合度可達(dá)80%-90%圖1無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞形態(tài)(×100)Figure1Cellmorphologyofhumanembryonicstemcellsonfeeder-freeplates(×100)圖注：通過(guò)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞均表達(dá)其特異性標(biāo)志物SOX2和OCT4圖2人胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)(×100)Figure2Expressionofspecificmolecularmarkersofhumanembryonicstemcells(×100)圖注：圖中A-C為小克隆傳代，其中A為轉(zhuǎn)染前明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)，B為轉(zhuǎn)染2d后明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)，C為B圖對(duì)應(yīng)的熒光圖；D-F為單細(xì)胞傳代，其中D為轉(zhuǎn)染前明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)，E為轉(zhuǎn)染2d后明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)，F(xiàn)為E圖對(duì)應(yīng)的熒光圖圖3兩種不同方法傳代后的人胚胎干細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染pAdTrack-AKT1熒光質(zhì)粒后的綠色熒光蛋白表達(dá)(×100)Figure3HumanembryonicstemcellswithtwopassagemethodsandexpressionofgreenfluorescentproteinafterpAdTrack-AKT1transfection(×100)小克隆傳代單細(xì)胞傳代100806040200轉(zhuǎn)染效率(%)P<0.01小克隆傳代單細(xì)胞傳代小克隆傳代單細(xì)胞傳代小克隆傳代單細(xì)胞傳代3210P<0.01P<0.01AKT1蛋白表達(dá)水平AKT1mRAN表達(dá)水平543210AKT1GAPDH圖注：圖中A為小克隆傳代流式檢測(cè)代表圖；B為單細(xì)胞傳代流式檢測(cè)代表圖；C為兩組人?
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫莉;縱艷艷;魏建峰;;兩種傳代方法影響人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較[J];中國(guó)組織工程研究;2020年01期

2 馮子岑;溫玉琪;王夢(mèng)鴿;涂茜;王洪濤;王征宇;周家喜;;BET bromodomain蛋白在人胚胎干細(xì)胞造血分化中的作用研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2018年04期

3 屈丁楠;;人胚胎干細(xì)胞的研究與應(yīng)用[J];技術(shù)與市場(chǎng);2016年11期

4 白鴿;李謙;王大鵬;鐘輝;;從復(fù)審角度評(píng)析人胚胎干細(xì)胞的可專利性[J];中國(guó)發(fā)明與專利;2017年11期

5 譚之揚(yáng);金磊;趙文秀;馬嵐;;人胚胎干細(xì)胞膜的特異多肽受體研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年31期

6 徐蘭;李斌;;人胚胎干細(xì)胞建系和培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年32期

7 錢坤;陳紅;張?zhí)K明;朱桂金;;人成纖維細(xì)胞對(duì)人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的支持作用[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年04期

8 謝蜀生;應(yīng)當(dāng)重視人胚胎干細(xì)胞的研究[J];科技導(dǎo)報(bào);2000年05期

9 王治;王淑娜;徐添穎;李志勇;張賽龍;繆朝玉;;煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因編輯對(duì)人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究[J];藥學(xué)實(shí)踐雜志;2019年03期

10 陳紅,錢坤,張?zhí)K明,朱桂金;人胚胎干細(xì)胞建系及體外誘導(dǎo)分化的研究進(jìn)展[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2004年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 孫平新;人胚胎干細(xì)胞分化為自我更新的神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞研究[D];中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2019年

2 高偉;酒精對(duì)人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響[D];湖南大學(xué);2015年

3 陳勇;人胚胎干細(xì)胞源肺類器官平臺(tái)的建立與應(yīng)用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2019年

4 方貞付;人胚胎干細(xì)胞和兔胚胎干細(xì)胞的建系與鑒定[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2005年

5 黃華榮;單層貼壁法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化及其機(jī)制初探[D];浙江大學(xué);2006年

6 羅春花;人胚胎干細(xì)胞（hESCs）的生長(zhǎng)與分化調(diào)控[D];重慶大學(xué);2016年

7 趙振強(qiáng);不同飼養(yǎng)層對(duì)人胚胎干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

8 劉曉芳;誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化及其機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

9 文采;多孔礦化水凝膠材料誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞成骨分化的研究[D];東南大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王旭;干擾Hi-Lnc70和miR-375對(duì)人胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2019年

2 李夏;人胚胎干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 崔慧霞;人胚胎干細(xì)胞抗氧化特性的探究[D];廈門大學(xué);2017年

4 祝賀;無(wú)滋養(yǎng)層無(wú)血清體系下人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[D];中南民族大學(xué);2016年

5 趙海軍;不同造血微環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的影響[D];中南大學(xué);2007年

6 鄭東燕;SWI/SNF染色體重塑復(fù)合物在人胚胎干細(xì)胞中的功能研究[D];華東師范大學(xué);2011年

7 時(shí)良;尿源非整合誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞及與人胚胎干細(xì)胞基因表達(dá)譜比對(duì)分析[D];濟(jì)南大學(xué);2017年

8 李欣恬;ALX家族基因在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)嵴細(xì)胞中的作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2017年

9 彭道琥;小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編過(guò)程中p53、MDM2、Aurka基因相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究[D];西南醫(yī)科大學(xué);2017年

10 楊鵬飛;人胚胎干細(xì)胞低溫保存問(wèn)題的初步研究[D];上海理工大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2868018