背景:現(xiàn)有方法將外源分子如DNA導入到人胚胎干細胞用于科學研究的效率普遍較低,如何優(yōu)化現(xiàn)有條件,提高轉染效率顯得尤為重要。目的:比較兩種不同的傳代方法對人胚胎干細胞系H9轉染效率的影響,優(yōu)化胚胎干細胞轉染條件。方法:人胚胎干細胞系H9分別采用小克隆傳代法和單細胞傳代法進行傳代,傳代后繼續(xù)培養(yǎng)細胞48h,用Lipofectamine 3000轉染p AdTrack-AKT1熒光質粒2 d后,熒光顯微鏡下觀察熒光質粒的表達,流式細胞儀檢測人胚胎干細胞的轉染效率;RT-qPCR和Westernblot分別檢測轉染后AKT1在mRNA和蛋白質水平的表達。結果與結論:①熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)單細胞傳代組表達熒光質粒的細胞數(shù)量更多,流式細胞儀檢測單細胞傳代法的轉染效率[(47.18±2.00)%]高于小克隆傳代法的轉染效率[(19.52±0.86)%],差異有顯著性意義(P0.01);②單細胞傳代組轉染后AKT1 mRNA和蛋白的表達均高于小克隆傳代組,差異有顯著性意義(P 0.01);③結果表明,采用單細胞傳代法,增加細胞與轉染試劑脂質體的接觸面積可提高人胚胎干細胞的轉染效率。
【部分圖文】：

妝澩鎪?劍?峁?礱韉ハ赴???ń檔拖?胞匯合度和細胞間的緊密程度可明顯提高人胚胎干細胞的轉染效率；同時也發(fā)現(xiàn)細胞密度過小，脂質體毒性作用明顯，細胞死亡增多，轉染效率亦不高。因此，轉染前優(yōu)化圖注：圖中A-C分別為培養(yǎng)第1，3，7天時的細胞形態(tài)，培養(yǎng)7d時細胞匯合度可達80%-90%圖1無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的人胚胎干細胞形態(tài)(×100)Figure1Cellmorphologyofhumanembryonicstemcellsonfeeder-freeplates(×100)圖注：通過細胞免疫熒光檢測，結果發(fā)現(xiàn)人胚胎干細胞均表達其特異性標志物SOX2和OCT4圖2人胚胎干細胞特異性標志物的表達(×100)Figure2Expressionofspecificmolecularmarkersofhumanembryonicstemcells(×100)圖注：圖中A-C為小克隆傳代，其中A為轉染前明場下細胞形態(tài)，B為轉染2d后明場下細胞形態(tài)，C為B圖對應的熒光圖；D-F為單細胞傳代，其中D為轉染前明場下細胞形態(tài)，E為轉染2d后明場下細胞形態(tài)，F(xiàn)為E圖對應的熒光圖圖3兩種不同方法傳代后的人胚胎干細胞形態(tài)及轉染pAdTrack-AKT1熒光質粒后的綠色熒光蛋白表達(×100)Figure3HumanembryonicstemcellswithtwopassagemethodsandexpressionofgreenfluorescentproteinafterpAdTrack-AKT1transfection(×100)小克隆傳代單細胞傳代100806040200轉染效率(%)P<0.01小克隆傳代單細胞傳代小克隆傳代單細胞傳代小克隆傳代單細胞傳代3210P<0.01P<0.01AKT1蛋白表達水平AKT1mRAN表達水平543210AKT1GAPDH圖注：圖中A為小克隆傳代流式檢測代表圖；B為單細胞傳代流式檢測代表圖；C為兩組人?
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