差速離心法聯(lián)合聚乙二醇6000富集脂肪間充質(zhì)干細胞來源的外泌體
發(fā)布時間：2020-10-28 17:58
目的探討通過聚乙醇6000(PEG 6000)富集分離外泌體,優(yōu)化改善外泌體的分離產(chǎn)量。方法使用不同濃度PEG 6000分離外泌體,通過Western blot檢測CD63的蛋白表達情況,篩選出最適濃度的PEG6000。以差速離心法分離出的外泌體為對照組,以最適濃度PEG 6000分離出的外泌體為實驗組,比較兩者之間的外泌體粒徑、數(shù)量,蛋白水平(CANX、CD81、TSG101)的表達情況和miRNA(miR-133b和miR-124-3p)的表達情況。結(jié)果使用不同濃度PEG6000分離外泌體,12%PEG6000分離出的外泌體產(chǎn)量最多,最終篩選最適PEG6000濃度為12%完成后續(xù)實驗。12%PEG 6000分離的外泌體和差速離心法分離出的外泌體作比較,前者的外泌體產(chǎn)量為1.35×10~8個/ml培養(yǎng)基,后者的外泌體的產(chǎn)量為6.8×10~7個/ml培養(yǎng)基。從蛋白水平(CANX、CD81、TSG101)的表達情況來看,同體積上樣量和同蛋白上樣量,PEG 6000分離的外泌體的蛋白表達水平遠高于差速離心法分離出的外泌體。從miRNA(miR-133b和miR-124-3p)的表達情況來看,PEG6000分離的外泌體的miR-133b和miR-124-3p表達水平遠高于差速離心法分離出的外泌體。PEG6000分離出的外泌體并不會影響成纖維細胞對其進行攝取,而且PEG6000分離出的外泌體的產(chǎn)量遠比差速離心分離出的外泌體的產(chǎn)量多。結(jié)論 12%PEG6000分離出的外泌體的產(chǎn)量優(yōu)于差速離心法分離出的外泌體,且不影響外泌體的穩(wěn)定性。
【部分圖文】：
將使用12%PEG 6000分離200 ml培養(yǎng)基所獲得的外泌體和超速離心分離350 ml培養(yǎng)基所獲得的外泌體進行蛋白標志物鑒定、電鏡分析、NTA檢測（圖3）。按照同體積和同蛋白量上樣進行CANX、TSG101和CD81鑒定。其中，無論是同體積還是同蛋白做Western blot鑒定，PEG 6000分離出的外泌體的目的蛋白量都遠大于差速離心法分離出的外泌體的量。電鏡結(jié)果顯示差速離心（圖3E）和PEG沉淀（圖3F）所得外泌體均為茶托樣的雙層膜結(jié)構(gòu)。NTA結(jié)果顯示，PEG 6000分離出的外泌體的濃度為1.35×108個/ml，差速離心分離出的外泌體的濃度為6.8×107個/ml;PEG 6000分離出的外泌體粒徑大小為（126.6±2.09)nm，差速離心分離出的外泌體的粒徑大小為（137.8±3.8)nm。實驗結(jié)果表明，12%PEG 6000分離出的外泌體產(chǎn)量比差速離心分離出的產(chǎn)量高得多，且PEG并不影響外泌體的粒徑大小。圖2 h Ad MSCs成脂、成骨、成軟骨分化潛能鑒定（A：正常h Ad MSCs細胞形態(tài)；B：油紅O染色；C：茜素紅S染色；D：阿利新藍染色；標尺：100μm)
圖1 h Ad MSCs表面標志性抗原流式鑒定結(jié)果（A：總細胞散點分布；B：陰性對照；C～E:CD73+、CD90+、CD105+細胞比例）2.4 PEG 6000和差速離心分離出的外泌體的mi RNA的表達情況
在此次研究中，使用12%PEG 6000分離P3代h Ad MSC產(chǎn)生的外泌體。該方法分離出的外泌體與金標準差速離心法分離出的外泌體高度相似，且產(chǎn)量遠勝于差速離心法。h Ad MSC來源的外泌體表達四跨膜蛋白超家族的CD63和CD81以及腫瘤易感基因TSG101，不表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源蛋白，如鈣連接蛋白（calnexin,CANX)[23]。使用不同濃度的PEG 6000進行h Ad MSC來源的外泌體分離，可以發(fā)現(xiàn)，12%和16%濃度的PEG所分離出來的外泌體CD63表達量最多。但是，考慮到PEG的非降解性和免疫原性[24-25]，后續(xù)實驗使用12%PEG 6000進行分離外泌體。通過Western blot可以發(fā)現(xiàn)，不管是同體積上樣還是同蛋白量上樣，PEG 6000分離出的外泌體CD81和TSG101的蛋白表達量都高于差速離心法，且兩種方法分離出的外泌體都不表達CANX。從粒徑大小和濃度來看，PEG 6000捕獲的囊泡數(shù)量更多；從mi RNA水平和成纖維細胞攝取外泌體的情況來看，PEG 6000并不影響外泌體的mi RNA的表達水平以及成纖維細胞攝取外泌體的能力，相反效果更好。
【相似文獻】
本文編號：2860418
【部分圖文】：
將使用12%PEG 6000分離200 ml培養(yǎng)基所獲得的外泌體和超速離心分離350 ml培養(yǎng)基所獲得的外泌體進行蛋白標志物鑒定、電鏡分析、NTA檢測（圖3）。按照同體積和同蛋白量上樣進行CANX、TSG101和CD81鑒定。其中，無論是同體積還是同蛋白做Western blot鑒定，PEG 6000分離出的外泌體的目的蛋白量都遠大于差速離心法分離出的外泌體的量。電鏡結(jié)果顯示差速離心（圖3E）和PEG沉淀（圖3F）所得外泌體均為茶托樣的雙層膜結(jié)構(gòu)。NTA結(jié)果顯示，PEG 6000分離出的外泌體的濃度為1.35×108個/ml，差速離心分離出的外泌體的濃度為6.8×107個/ml;PEG 6000分離出的外泌體粒徑大小為（126.6±2.09)nm，差速離心分離出的外泌體的粒徑大小為（137.8±3.8)nm。實驗結(jié)果表明，12%PEG 6000分離出的外泌體產(chǎn)量比差速離心分離出的產(chǎn)量高得多，且PEG并不影響外泌體的粒徑大小。圖2 h Ad MSCs成脂、成骨、成軟骨分化潛能鑒定（A：正常h Ad MSCs細胞形態(tài)；B：油紅O染色；C：茜素紅S染色；D：阿利新藍染色；標尺：100μm)
圖1 h Ad MSCs表面標志性抗原流式鑒定結(jié)果（A：總細胞散點分布；B：陰性對照；C～E:CD73+、CD90+、CD105+細胞比例）2.4 PEG 6000和差速離心分離出的外泌體的mi RNA的表達情況
在此次研究中，使用12%PEG 6000分離P3代h Ad MSC產(chǎn)生的外泌體。該方法分離出的外泌體與金標準差速離心法分離出的外泌體高度相似，且產(chǎn)量遠勝于差速離心法。h Ad MSC來源的外泌體表達四跨膜蛋白超家族的CD63和CD81以及腫瘤易感基因TSG101，不表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源蛋白，如鈣連接蛋白（calnexin,CANX)[23]。使用不同濃度的PEG 6000進行h Ad MSC來源的外泌體分離，可以發(fā)現(xiàn)，12%和16%濃度的PEG所分離出來的外泌體CD63表達量最多。但是，考慮到PEG的非降解性和免疫原性[24-25]，后續(xù)實驗使用12%PEG 6000進行分離外泌體。通過Western blot可以發(fā)現(xiàn)，不管是同體積上樣還是同蛋白量上樣，PEG 6000分離出的外泌體CD81和TSG101的蛋白表達量都高于差速離心法，且兩種方法分離出的外泌體都不表達CANX。從粒徑大小和濃度來看，PEG 6000捕獲的囊泡數(shù)量更多；從mi RNA水平和成纖維細胞攝取外泌體的情況來看，PEG 6000并不影響外泌體的mi RNA的表達水平以及成纖維細胞攝取外泌體的能力，相反效果更好。
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本文編號：2860418
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