目的通過檢測PTEN基因不同表達(dá)黑色素瘤模型小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的比例及數(shù)量變化,探索PTEN在黑色素瘤免疫逃逸中的機(jī)制。方法將72只同系C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三組,每組24只:A組注入0.2ml的RPMI-1640培養(yǎng)液;B組注入0.2ml濃度為4×10~6/ml的(PTEN~(+/+)-B16F10);C組注入0.2ml濃度為4×10~6/ml的(PTEN~(-/-)-B16F10)。接種后第7日開始每隔5天每組選6只小鼠制備脾臟單細(xì)胞懸液,分析CD3~+T、CD4~+T、CD8~+T相對數(shù)量及CD28~+/CD8~+的比例。結(jié)果 A組CD3~+T、CD4~+T在D7、D12、D17組內(nèi)比較無差異,分別與D22比較差異有顯著性。CD8~+T、CD28~+/CD8~+比例及數(shù)量基本平穩(wěn)。B組、C組各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較差異有顯著性。B組下降幅度分別為:79.8%、82.6%、65.37%、58.69%。C組下降幅度分別為:89.62%、89.24%、84.85%、70.53%。組間比較D7、D12,C組B組無差異,D17、D22,C組B組差異有顯著性。結(jié)論 PTEN基因缺失表達(dá)促進(jìn)了黑色素腫瘤的生長,通過降低小鼠體內(nèi)T細(xì)胞亞群的相對數(shù)量,降低了機(jī)體的抗腫瘤能力,參與黑色素瘤對機(jī)體的免疫逃逸,從而促進(jìn)了黑色素瘤的發(fā)生及發(fā)展。
【部分圖文】：

圖1 倒置熒光顯微鏡下觀察PTEN+/+-B16F10細(xì)胞（×100)免疫細(xì)胞表面分子染色：接種腫瘤細(xì)胞第7天（D7）開始，每隔5天，隨機(jī)選取A、B、C組各6只小鼠。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑量為0.3ml/100g體重，麻醉起效后處死，設(shè)計(jì)腹腔切口，無菌分離脾臟，EP管中剪碎，研磨，沖洗，收集細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞2分鐘，1200r/min離心10min后棄去上清，重懸，計(jì)數(shù)。準(zhǔn)備18支流式管，分3組，每組6支，對應(yīng)加入細(xì)胞，數(shù)量約1×107個(gè)，體積100微升，將CD3、CD4、CD8、CD28抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)，避光染色30min。細(xì)胞染色緩沖液離心洗滌2次，1000r/min,10min，充分混勻、避光30min,PBS重懸100～200微升，操作均在4℃冰盒上進(jìn)行。

荷瘤小鼠PTEN的表達(dá)

建立PTEN不同表達(dá)的荷瘤小鼠模型：將PTEN+/+-B16F10,PTEN-/--B16F10細(xì)胞（圖1、2）分別皮下接種同系C57BL小鼠，實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為三組（A=24;B=25;C=25):A組注入0.2ml的RPMI-1640培養(yǎng)液；B組注入0.2ml濃度為4×106/ml的（PTEN+/+-B16F10);C組注入0.2ml濃度為4×106/ml的（PTEN-/--B16F10）。模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)：B組、C組小鼠背部可見直徑約為5mm大小黑結(jié)節(jié)，突出皮膚表面。分別B、C組各取一只動物，取腫瘤組織免疫印跡法檢測PTEN表達(dá)情況。圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察PTEN-/--B16F10細(xì)胞（×100)
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本文編號：2860603