目的構(gòu)建含有ZIKA病毒全基因組的載體,在真核細(xì)胞中產(chǎn)生具有復(fù)制能力的ZIKA病毒。方法將ZIKA病毒全長(zhǎng)基因組序列、CMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子、HDV核酶、SV40終止子序列利用PCR的方法進(jìn)行拼接,應(yīng)用重組技術(shù)將ZIKA全基因組序列克隆至細(xì)菌人工染色體載體pBAC11中,產(chǎn)生重組子pBAC-ZIKAi。將pBAC-ZIKA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中進(jìn)行ZIKA病毒拯救,7 d將上清用0.45μm濾膜濾過(guò)后(ZIKA病毒P0代)感染Vero細(xì)胞(產(chǎn)生ZIKA病毒P1代),依此進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用熒光定量PCR、TCID_(50)、噬斑實(shí)驗(yàn)等技術(shù)檢測(cè)ZIKA拯救病毒的復(fù)制能力、致病力與野生病毒的差別。結(jié)果含有內(nèi)含子的ZIKA全基因組序列的感染性克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒,并且在第5代病毒仍穩(wěn)定存在引入的G3128A鑒定標(biāo)記。分別用拯救病毒與野生病毒感染Vero細(xì)胞,用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒RNA,顯示拯救病毒的復(fù)制能力與野生病毒無(wú)明顯差別。TCID_(50)檢測(cè)上清中的病毒滴度也相似。噬斑試驗(yàn)中比對(duì)兩種病毒形成的噬斑均為大小一致、均勻的圓形,提示兩者致病性一致。結(jié)論通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的全長(zhǎng)ZIKA病毒基因組感染克隆具有復(fù)制能力,為ZIKA病毒的反向遺傳學(xué)研究提供了理論基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

流程圖見(jiàn)圖1。由廣州市艾基生物技術(shù)有限公司合成CMV啟動(dòng)子序列,采用PCR的方法與寨卡病毒序列(1-5908 nt)融合產(chǎn)生寨卡病毒感染性克隆前段序列(ZF);由廣州市艾基生物技術(shù)有限公司合成HDV的核酶序列和SV40polyA序列,應(yīng)用PCR方法與寨卡病毒序列(5735-10807 nt)進(jìn)行拼接產(chǎn)生寨卡病毒感染性克隆后段序列(ZR)。采用Infusion試劑盒,將片段ZF、ZR與核酸內(nèi)切酶(Sfo I、Pac I)切割后質(zhì)粒pBAC11進(jìn)行重組,產(chǎn)生重組子pBAC-ZIKA。由廣州市艾基生物技術(shù)有限公司合成內(nèi)含子(intron)序列(來(lái)自于載體質(zhì)粒pCI-neo),應(yīng)用PCR方法插入寨卡病毒前段序列ZF(3128與3129nt之間)產(chǎn)生片段序列Zfi(將3128G突變?yōu)锳,作為后續(xù)檢測(cè)標(biāo)記),將ZFi、ZR與同上酶切的載體pBAC11進(jìn)行重組,產(chǎn)生重組子pBAC-ZIKAi。上述載體質(zhì)粒的擴(kuò)增均用DH10B細(xì)菌。

按圖1流程產(chǎn)生的克隆pBAC-ZIKA轉(zhuǎn)染293T,不能產(chǎn)生具有感染性的病毒。提取細(xì)胞內(nèi)的RNA,進(jìn)行分片段PCR部分片段無(wú)擴(kuò)增(圖2A),提示當(dāng)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的RNA在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了不正確的剪接。為了讓細(xì)胞正確產(chǎn)生完整病毒RNA,在病毒基因組中引入內(nèi)含子序列,產(chǎn)生克隆pBAC-ZIKAi并進(jìn)行了G3128A突變,作為后續(xù)病毒鑒定檢測(cè)的標(biāo)記。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞7 d后收集上清,檢測(cè)顯示產(chǎn)生了具有感染性的病毒, PCR擴(kuò)出所有片段(圖2 B),提示引入內(nèi)含子序列的克隆其RNA在細(xì)胞內(nèi)可以正確剪接。測(cè)序顯示,第5代病毒仍然保持著G3128A突變,說(shuō)明拯救病毒可穩(wěn)定傳代和增殖(圖3)。2 病毒的復(fù)制能力

分別于細(xì)胞感染病毒12、24、48 h后應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的含量,結(jié)果顯示拯救病毒的RNA可在Vero細(xì)胞中擴(kuò)增,與野生病毒的RNA擴(kuò)增速度相似(圖4 A);將收集培養(yǎng)上清進(jìn)行TCID50試驗(yàn),兩種病毒滴度也相似(圖4B)。結(jié)果表明拯救病毒與野生病毒在復(fù)制能力上相似。3 病毒的致病性
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