發(fā)布時(shí)間：2017-04-04 21:11

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌PPE25、PPE27和PE19蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響及表達(dá)ppe25基因的重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染引起的慢性呼吸道傳染病,世界上三分之一的人口已被感染,每年新發(fā)病例接近九百萬(wàn)例,它在世界范圍內(nèi)傳播、發(fā)病是其盛行的原因之一。pe/ppe基因占據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因組編碼區(qū)的10%,PE/PPE蛋白家族中一些成員被鑒定為是毒力因子,參與宿主免疫反應(yīng),但大部分PE/PPE蛋白的確切功能還需要探索,其中包括PPE25、PPE27和PE19蛋白。本研究利用原核體系表達(dá)和純化獲得的PPE25、PPE27、PE19蛋白與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7相互作用以初步解析其生物功能。此外,為以后更深入地研究該家族蛋白的功能和在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的作用,成功構(gòu)建了帶有FLAG標(biāo)簽的重組穿梭表達(dá)載體pMV261-ppe25,并電轉(zhuǎn)化至無(wú)毒快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌,從而獲得重組菌株。1.結(jié)核分枝桿菌PPE25、PPE27和PE19蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞因子和死亡方式的影響純化獲得重組蛋白PPE25.PPE27和PE19,去除內(nèi)毒素后經(jīng)過(guò)鱟試劑測(cè)定內(nèi)毒素含量,BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照濃度0、1.25、2.5、5.0和10.0μg/mL分別刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,作用24 h后,用Cell Proliferation ELISA BrdU (Colorimetric)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)PPE25、PPE27和PE19對(duì)RAW264.7的活性有顯著的抑制作用(p0.05),且呈現(xiàn)劑量依賴性。重組蛋白以不同濃度作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7,作用24和48 h采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞死亡方式。結(jié)果顯示,PPE25、PPE27和PE19都導(dǎo)致RAW264.7發(fā)生細(xì)胞壞死,說(shuō)明PPE25、PPE27和PE19蛋白都具有毒性。同時(shí),應(yīng)用液體懸浮芯片系統(tǒng)luminex200方法檢測(cè)不同濃度的重組蛋白PPE25、PPE27和PE19與RAW264.7相互作用后培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表達(dá)量的變化,從而評(píng)價(jià)PPE25、PPE27和PE19對(duì)RAW264.7炎性反應(yīng)的影響。重組蛋白PPE25、PPE27和PE19分別以1.25、2.5、5.0和10.0 μg/mL的濃度刺激RAW264.7,作用24和48h后,與空白組相比,重組蛋白PPE25引起IL-6分泌量顯著上調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量有所上升。重組蛋白PE19引起IL-6分泌量顯著上調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量沒(méi)有明顯差異。然而重組蛋白PPE27引起IL-6分泌量顯著下調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量也下調(diào)。此外,重組蛋白PPE25、PPE27和PE19促使巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)量均低于檢測(cè)線2.13 pg/mL,IL-12p40表達(dá)量均低于檢測(cè)線2.09 pg/mL。這些差異表達(dá)證實(shí)重組蛋白PPE25、PPE27和PE19可以通過(guò)調(diào)控促炎性因子IL-6的表達(dá)引起巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答。2.表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ppe25基因的重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增ppe25基因序列并添加FLAG標(biāo)簽,以便Western-blot檢測(cè)其表達(dá)。將PCR產(chǎn)物定向克隆到克隆載體pCR2.1,測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的基因序列完全一致。經(jīng)BamH I/EcoR I雙酶切獲得ppe25酶切片段,克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV261,通過(guò)酶切及PCR鑒定正確后,將重組質(zhì)粒pMV261-ppe25電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài),構(gòu)建、篩選重組恥垢分枝桿菌,命名為rMS-pMV261-ppe25。重組恥垢分枝桿菌的PCR和酶切鑒定表明構(gòu)建正確。重組菌經(jīng)45℃30min誘導(dǎo)表達(dá),超聲裂解后的Western-blot結(jié)果表明,目的蛋白與抗PPE25兔多抗血清和抗FLAG標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性的反應(yīng),與預(yù)期條帶大小39.51kD一致。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 PE/PPE蛋白 RNW264.7 恥垢分枝桿菌
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-7
• 符號(hào)說(shuō)明7-9
• 綜述：結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞的相互作用9-20
• 1 巨噬細(xì)胞的PRRs與MTB相互作用9-13
• 2 巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子13-14
• 3 巨噬細(xì)胞死亡方式14-16
• 參考文獻(xiàn)16-20
• 第一章 結(jié)核分枝桿菌PPE25、PPE27和PE19蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞因子和死亡方式的影響20-41
• 1 材料與方法21-24
• 2 結(jié)果24-37
• 4 討論37-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 第二章 表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ppe25基因的重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建41-54
• 1 材料與方法41-47
• 2 結(jié)果47-51
• 3 討論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 致謝54-55

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 叢林;夏志寬;楊蓉婭;;補(bǔ)體對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞吞噬阿薩希毛孢子菌的增強(qiáng)作用[J];實(shí)用皮膚病學(xué)雜志;2013年04期

2 張英林;楊巍;孫際童;牛坤偉;付海英;;轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對(duì)RAW264.7細(xì)胞表型及免疫抑制相關(guān)基因的影響[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2013年12期

3 馮友梅;陳慶;周潔;陳娟;曾和松;;瘦素對(duì)RAW264.7細(xì)胞腫瘤壞死因子α表達(dá)的影響(英文)[J];中國(guó)臨床康復(fù);2006年36期

4 胡亞娥;茅家慧;劉霞;施海燕;朱燕;周愛玲;;氧化苦參堿對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞一氧化氮及其誘導(dǎo)型合酶表達(dá)的影響[J];南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

5 韓莎莎;李俊峽;;不同濃度超順磁性氧化鐵納米粒子對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響[J];中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

6 潘慶軍;朱學(xué)芝;劉淵;;水合氯醛誘發(fā)RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡及其機(jī)制[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2014年02期

7 王春;許燦新;嚴(yán)鵬科;陳琳玲;李凱;廖端芳;;巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)RAW264.7細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9分泌的影響[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2006年02期

8 李浩;殷瑛;董大勇;張軍;付玲;任軍;徐俊杰;陳薇;;結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白EspB在RAW264.7細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)[J];微生物學(xué)報(bào);2011年07期

9 方瑤;毛旭虎;;小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)技巧及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年22期

10 張鵬宇;王世瑤;霍德勝;徐桂月;張學(xué)軍;柳忠輝;;激活素A對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用[J];免疫學(xué)雜志;2006年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊江濤;董曉芳;佟建明;劉晴雪;張琪;吳瑩瑩;;苜草素多糖、黃酮和皂苷對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7β-防御素基因表達(dá)的影響[A];第六次全國(guó)飼料營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 王艷;鄭群;王一松;朱俊萍;曹寧;平國(guó)玲;張力平;;鏈球菌蛋白對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用[A];2008年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

3 覃麗;胡蓉;姚海倫;凌紅艷;廖端芳;;wnt5a對(duì)荷脂巨噬細(xì)胞RAW264.7中膽固醇蓄積的影響及相關(guān)機(jī)制[A];傳承與發(fā)展，創(chuàng)湖南省生理科學(xué)事業(yè)的新高——湖南省生理科學(xué)會(huì)2011年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

4 趙國(guó)陽(yáng);徐又佳;;鐵調(diào)素對(duì)小鼠單核細(xì)胞RAW264.7向破骨細(xì)胞分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

5 周江睿;黃俊龍;蔣春雷;;神經(jīng)肽Y對(duì)RAW264.7細(xì)胞腫瘤壞死因子α產(chǎn)生的影響及其可能機(jī)制[A];2008年神經(jīng)內(nèi)分泌暨神經(jīng)免疫內(nèi)分泌學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

6 周壽紅;劉立英;陳庚容;唐密密;楊旭紅;;對(duì)氧磷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)和膽固醇流出的影響[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2008年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

7 蘇子杰;鐘舒紅;尹丹;崔月明;韋英益;胡庭俊;;山豆根多糖對(duì)PCV-2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)中獸醫(yī)學(xué)分會(huì)2013年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

8 趙國(guó)陽(yáng);徐又佳;;鐵調(diào)素對(duì)小鼠單核細(xì)胞RAW264.7向破骨細(xì)胞分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次中青年骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2013年

9 陳旭林;郭峰;王飛;王永杰;;不同濃度的LPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞血管緊張素Ⅱ1型受體表達(dá)的影響[A];第七屆全國(guó)創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會(huì)議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

10 于化鵬;梁海梅;;NLRP3/IL-18和IL-33在脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥中表達(dá)及其意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2013第十四次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 朱潔萍;睪酮對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響及分子機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李忱煒;肺炎鏈球菌溶血素對(duì)細(xì)菌毒力的影響及誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

2 黃諳非;Adipophilin促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ACAT1高表達(dá)[D];南華大學(xué);2008年

3 郭峰;血管緊張素Ⅱ1型受體在RAW264.7巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及其在炎癥介質(zhì)產(chǎn)生中的作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

4 張學(xué)敏;硫色滿酮衍生物激活RAW264.7細(xì)胞及體外抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究[D];河北大學(xué);2014年

5 續(xù)力云;新型免疫分子Tim-4對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7生物學(xué)活性的影響[D];山東大學(xué);2008年

6 李宇寧;內(nèi)體成熟障礙對(duì)LPS在RAW264.7細(xì)胞的內(nèi)化以及對(duì)細(xì)胞活化的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

7 劉超;抗菌肽hCAP-18/LL-37基因轉(zhuǎn)染對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7活化功能的影響[D];吉林大學(xué);2010年

8 王艷紅;伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的體外作用研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2014年

9 聶建巍;γ-干擾素增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷阿薩希毛孢子菌的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

10 蔣春霞;Rab6在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬過(guò)程中的作用[D];浙江大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌PPE25、PPE27和PE19蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響及表達(dá)ppe25基因的重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：285918