本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌Cas2（Rv2816c）在脅迫應(yīng)答及胞內(nèi)存活中的作用與分子機理，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,它仍然是中國乃至世界上威脅人類健康的重要傳染病。世界人口中大約有1/3是結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染者,每年死于結(jié)核病的人大約有130萬[1]。導(dǎo)致結(jié)核病難以攻克的主要原因是多重耐藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn)以及與HIV共感染。因此,需要對結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行更加深入的基礎(chǔ)研究。結(jié)核分枝桿菌在體外生長的過程中面臨著病毒——噬菌體的威脅,噬菌體在地球上幾乎無處不在。面對噬菌體的威脅,細(xì)菌逐漸進(jìn)化出了一系列的抗噬菌體機制,例如：限制性內(nèi)切酶、流產(chǎn)感染[2],以及clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)是一個最近幾年發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌抗噬菌體機制,它存在于90%的古生菌以及40%的細(xì)菌基因組中[3,4],它為細(xì)菌和古生菌提供了一套獲得性噬菌體抵抗機制。CRISPR系統(tǒng)含有由一系列被非重復(fù)的間隔序列分散的短的重復(fù)序列。此外,它還包含一個前導(dǎo)序列和周圍CRISPR-相關(guān)的基因(CAS)[5]。不同的Cas蛋白的功能各不相同,例如核糖核酸酶、解旋酶、聚合酶等。最近有研究證明,CRISP R位點具有基因表達(dá)調(diào)控的功能[6]。Francisella novicida的Cas9蛋白能夠調(diào)控編碼脂蛋白的基因FTN_1103的表達(dá)[7]。CRISPR中與自身基因組中的DNA序列同源的間區(qū)被報道與自身免疫及基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)[8,9]。Cas2已經(jīng)被報道是一個在間區(qū)獲得過程中起重要作用的保守的RNA核酸內(nèi)切酶[10-12],它廣泛分布于所有含有CRISPR序列的微生物基因組中[9,13,14]。Cas2對于L. pneumophila侵染其宿主,Hartmannella 和 Acanthamoeba以及逃避巨噬細(xì)胞免疫非常重要[15]。結(jié)核分枝桿菌基因組中具有兩個串聯(lián)的CRISPR結(jié)構(gòu),并且它們周圍有9個編碼CRISPR相關(guān)的蛋白的基因,其中包括編碼Cas2的Rv2816c[12]。當(dāng)用抑制代謝的抑制劑,例如抗生素、引起壓力的試劑等處理結(jié)核分枝桿菌后,Rv2816c的轉(zhuǎn)錄水平會發(fā)生變化[16]。因此我們推測Rv2816c可能涉及到結(jié)核分枝桿菌的抗壓力反應(yīng)以及抗生素抗性。本文通過將分枝桿菌Cas2的氨基酸序列與之前研究過的硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的Cas2氨基酸序列進(jìn)行比對,找到分枝桿菌Cas2的二級結(jié)構(gòu)元件以及它的催化活性位點,且發(fā)現(xiàn)Cas2在致病分枝桿菌中是非常保守的。我們用恥垢分枝桿菌作為模式菌株構(gòu)建了過表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Cas2 (Rv2816c)的重組恥垢分枝桿菌M. smegmatis-pALACE-Rv2816c。對 M. smegmatis-pALACE-Rv2816c表型進(jìn)行了觀察,并研究了Cas2對恥垢分枝桿菌胞外壓力反應(yīng)以及在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活率的影響。我們發(fā)現(xiàn)Cas2的表達(dá)改變了恥垢分枝桿菌的生長速率、單菌落形態(tài)、滑動能力以及生物膜的形成能力,這些表面形態(tài)的改變可能與Cas2引起的恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)成分的改變有關(guān)；此外,我們發(fā)現(xiàn)了Cas2引起的恥垢分枝桿菌壓力反應(yīng)的改變與SigB、SigE及SigH表達(dá)水平的改變有關(guān)。這三個Sigma因子涉及到分枝桿菌的壓力反應(yīng)以及毒力。我們還發(fā)現(xiàn)Cas2降低了M.smegmatis-pALACE-Rv2816c在巨噬細(xì)胞中的存活率,并伴隨著宿主細(xì)胞因子IL-6和IL-10的轉(zhuǎn)錄水平降低。我們的工作為Cas2功能的研究提供了新的方向。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 CRISPR系統(tǒng) Cas2 基因表達(dá)調(diào)控 壓力反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 第1章 綜述13-21
• 1.1 引言13
• 1.2 CRISPR概述13
• 1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成13-14
• 1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要類型14
• 1.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能14-16
• 1.5.1 適應(yīng)階段15
• 1.5.2 表達(dá)15
• 1.5.3 干擾15-16
• 1.6 CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用16
• 1.6.1 Cas蛋白被用于基因組編輯16
• 1.6.2 Cas蛋白應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控16
• 1.7 CRISR與噬菌體的共進(jìn)化16-17
• 1.8 CRISPR/Cas關(guān)于基因調(diào)控的研究17-19
• 1.8.1 調(diào)控病原菌毒力17-18
• 1.8.2 反義CRISPR RNA的調(diào)控作用18
• 1.8.3 基因調(diào)控可能的機制18-19
• 1.9 結(jié)核分枝桿菌中的CRISPR19
• 1.10 展望19-21
• 第2章 前言21-23
• 第3章 實驗材料和方法23-37
• 3.1 實驗材料23-26
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞23
• 3.1.2 主要試劑和材料23-24
• 3.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑的配置24-25
• 3.1.4 主要儀器和設(shè)備25-26
• 3.2 實驗方法26-37
• 3.2.1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組的提�。篊TAB法26
• 3.2.2 結(jié)核分枝桿菌Rv2816c基因PCR引物的設(shè)計與合成26
• 3.2.3 結(jié)核分枝桿菌Rv2816c基因擴增26
• 3.2.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化(熱激法)26-27
• 3.2.5 Rv2816c基因的TA克隆27
• 3.2.6 pALACE-Rv2816c穿梭載體構(gòu)建27-28
• 3.2.7 恥垢分枝桿菌感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化28-29
• 3.2.8 重組質(zhì)粒在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)及驗證29-30
• 3.2.9 菌落形態(tài)觀察30
• 3.2.10 生長曲線的測定30
• 3.2.11 滑動實驗30
• 3.2.12 恥垢分枝桿菌生物膜培養(yǎng)方法30
• 3.2.13 恥垢分枝桿菌脂肪酸分析30-31
• 3.2.14 氧化壓力的耐受性檢測31
• 3.2.15 SDS耐受性檢測31
• 3.2.16 酸耐受性檢測31-32
• 3.2.17 Trizol法提取恥垢分枝桿菌總RNA32
• 3.2.18 Rv2816c對相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響32-34
• 3.2.19 恥垢分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞后存活率檢測34-35
• 3.2.20 巨噬細(xì)胞被重組恥垢分枝桿菌侵染后總RNA的提取35
• 3.2.21 定量RT-PCR檢測M semgmatis-pALACE-Rv2816c侵染THP-1巨噬細(xì)胞后相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平35-37
• 第4章 結(jié)果與分析37-51
• 4.1 Cas2在致病分枝桿菌中是保守蛋白37
• 4.2 Rv2816c基因的PCR擴增及鑒定37-38
• 4.3 構(gòu)建M. smegmatis-pALACE-Rv2816c重組恥垢分枝桿菌38-39
• 4.4 Rv2816c基因在重組恥垢分枝桿菌中表達(dá)39
• 4.5 過表達(dá)Rv2816c基因使恥垢分枝桿菌的生長速度加快39-40
• 4.6 Rv2816c基因的過表達(dá)使恥垢分枝桿菌單菌落形態(tài)發(fā)生改變40
• 4.7 重組分枝桿菌的滑動能力降低40-41
• 4.8 過表達(dá)Rv2816c基因影響恥垢分枝桿菌生物膜的形成41-42
• 4.9 過表達(dá)Rv2816c基因?qū)u垢分枝桿菌中的脂質(zhì)成分無太大影響42
• 4.10 過表達(dá)Rv2816c基因使恥垢分枝桿菌對SDS敏感42-43
• 4.11 過表達(dá)Rv2816c基因使恥垢分枝桿菌對氧化壓力更敏感43-44
• 4.12 M. smegmatis-pALACE-Rv2816c對壓力條件的敏感由Sigma因子介導(dǎo)44-45
• 4.13 過表達(dá)Rv2816c基因使恥垢分枝桿菌對氧氟沙星和諾氟沙星敏感且是由活性氧介導(dǎo)的45-46
• 4.14 過表達(dá)Rv2816c基因使恥垢分枝桿菌對酸性條件敏感46-47
• 4.15 過表達(dá)Rv2816c基因降低恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活率47-48
• 4.16 Rv2816c基因的表達(dá)降低了恥垢分枝桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞因子的分泌48-51
• 第5章 結(jié)論與展望51-53
• 5.1 實驗結(jié)論與分析51-52
• 5.2 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-61
• 致謝61-63
• 在學(xué)校期間所發(fā)表的文章63

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1 黃琴琴;結(jié)核分枝桿菌Cas2（Rv2816c）在脅迫應(yīng)答及胞內(nèi)存活中的作用與分子機理[D];西南大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌Cas2（Rv2816c）在脅迫應(yīng)答及胞內(nèi)存活中的作用與分子機理，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：287192