本文關(guān)鍵詞：豬成纖維細(xì)胞系和神經(jīng)干細(xì)胞系的創(chuàng)建及iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)與生物學(xué)特征研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:干細(xì)胞研究是再生醫(yī)學(xué)的重要組成部分,研究干細(xì)胞的最終目的是應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病。誘導(dǎo)多能型干細(xì)胞(iPSc)是由體細(xì)胞誘導(dǎo)分化而成的“多能細(xì)胞”,具備和胚胎干細(xì)胞(ESCs)類(lèi)似的功能,既解決了ESCs的倫理障礙,又為ESCs的獲得提供了一條全新的途徑,具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病是目前公認(rèn)的最有前景的治療方案。在低氧條件下轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,能高效地誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元,為移植治療帕金森病提供細(xì)胞源。目的:(1)建立豬成纖維細(xì)胞系和神經(jīng)干細(xì)胞系并進(jìn)行生物學(xué)特征檢測(cè)。(2)初步建立以豬自身特異再程序化因子iPS細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)體系。方法:本實(shí)驗(yàn)首先以新生豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,建立成纖維細(xì)胞系和神經(jīng)干細(xì)胞系。繼而通過(guò)建立慢病毒介導(dǎo)的外源基因體外投遞系統(tǒng),對(duì)上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司iPS細(xì)胞誘導(dǎo)慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行改造,用豬自身再程序化因子進(jìn)行替代,進(jìn)一步利用慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)胴i成纖維細(xì)胞,構(gòu)建攜帶Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因高效率感染的病毒載體,進(jìn)而將其在體外誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。結(jié)果:(1)豬成纖維細(xì)胞系的創(chuàng)建:構(gòu)建22個(gè)個(gè)體豬成纖維細(xì)胞系,并對(duì)其遺傳特征及細(xì)胞系的生物學(xué)品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。為保證其遺傳學(xué)穩(wěn)定性,體外傳代次數(shù)少于4代。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)菌、真菌、支原體檢測(cè)、生長(zhǎng)曲線與核型分析等多項(xiàng)細(xì)胞系質(zhì)量檢測(cè),結(jié)果表明建立的豬成纖維細(xì)胞系遺傳性質(zhì)穩(wěn)定。利用6種熒光蛋白基因在所建細(xì)胞系中得到良好的表達(dá),說(shuō)明細(xì)胞具有良好的被轉(zhuǎn)染能力,為進(jìn)行豬特色功能基因的表達(dá)、定位和克隆化細(xì)胞的篩選奠定了基礎(chǔ)。(2)神經(jīng)干細(xì)胞系的創(chuàng)建:建立以新生豬大腦皮層為來(lái)源的NSC細(xì)胞系,利用體外培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。所獲得的豬NSC呈典型的神經(jīng)球生長(zhǎng),并表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性基因巢蛋白(Nestin),符合神經(jīng)干細(xì)胞的特性。誘導(dǎo)7d后,細(xì)胞具備分化為神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。我們對(duì)NSC分離培養(yǎng)的方法、細(xì)胞生物學(xué)特性以及影響其分離與增殖的因素進(jìn)行探索,為神經(jīng)干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。(3)iPS細(xì)胞系的誘導(dǎo):借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)入293FT細(xì)胞,并進(jìn)行重組病毒的包裝與滴度測(cè)定,進(jìn)而利用重組病毒感染新生豬神經(jīng)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo),獲得i PS細(xì)胞系,并對(duì)獲得iPS細(xì)胞進(jìn)行SSEA-1,SSEA-3與TRA-80-1表面抗原、標(biāo)記基因鑒定。結(jié)論:(1)成功建立了豬成纖維細(xì)胞系,并進(jìn)行了遺傳特征與生物學(xué)特征檢測(cè),為豬iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)提供了實(shí)驗(yàn)材料。(2)從新生豬大腦皮層中分離組織,制成單細(xì)胞懸液,利用機(jī)械法和酶消化法相結(jié)合的方法培養(yǎng)。鑒定培養(yǎng)出的神經(jīng)球證明其具有神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。凍存后重新復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并進(jìn)行一系列鑒定神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性的相關(guān)實(shí)驗(yàn),得出其仍具有NSC的特性。(3)針對(duì)豬成纖維細(xì)胞系與神經(jīng)干細(xì)胞建立了慢病毒介導(dǎo)的體外感染體系,成功構(gòu)建了攜帶Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因高效感染的病毒載體,利用重組病毒感染新生豬神經(jīng)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo),獲得了N-iPS細(xì)胞系,為豬的iPS細(xì)胞開(kāi)展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型移植治療奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬 成纖維細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞 生物學(xué)特征分析
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一章 豬成纖維細(xì)胞系的創(chuàng)建與生物學(xué)特征檢測(cè)14-28
• 引言14
• 材料與方法14-21
• 結(jié)果21-26
• 討論26-27
• 結(jié)論27-28
• 第二章 豬神經(jīng)干細(xì)胞系的創(chuàng)建與生物學(xué)特征檢測(cè)28-41
• 引言28
• 材料與方法28-34
• 結(jié)果34-39
• 討論39-40
• 結(jié)論40-41
• 第三章 豬iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定研究41-51
• 引言41
• 材料與方法41-44
• 結(jié)果44-49
• 討論49-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 致謝57-58
• 附錄A 中英文術(shù)語(yǔ)縮略語(yǔ)對(duì)照表58-59
• 附錄B 個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表論文59-60
• 附錄C 綜述60-72
• 參考文獻(xiàn)（References）69-72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張德福;戴建軍;吳彩鳳;;小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用前景[J];豬業(yè)科學(xué);2009年03期

  本文關(guān)鍵詞：豬成纖維細(xì)胞系和神經(jīng)干細(xì)胞系的創(chuàng)建及iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)與生物學(xué)特征研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：285815