感染性腹瀉與手足口病是嬰幼兒常見疾病,這兩種疾病一直占據(jù)我國丙類傳染病發(fā)病人數(shù)前兩位,不但嚴(yán)重威脅著嬰幼兒的健康及生存質(zhì)量,而且每年需要消耗大量的醫(yī)療衛(wèi)生資源,給家庭及社會帶來龐大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)研究表明,60%的5歲以下嬰幼兒感染性腹瀉是由A組輪狀病毒(Rotavirus,RV)感染引起的,手足口病則多由腸道病毒71型(EV71)感染引起。市場上目前尚無針對輪狀病毒及EV71型感染的特效藥物,接種相應(yīng)疫苗仍然是預(yù)防其感染的最有效方式。因此,發(fā)展能同時預(yù)防這兩種病毒感染的雙價疫苗十分必要。病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)疫苗因其缺乏核酸基因組和具有完全免疫原性正成為高效安全的新一代候選疫苗。本實驗室在前期已經(jīng)通過同時表達(dá)輪狀病毒的衣殼蛋白VP2、VP6和VP7成功構(gòu)建了輪狀病毒樣顆粒,其穩(wěn)定性和真實病毒粒子相似,但是其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的水平還有待于進(jìn)一步提高。研究發(fā)現(xiàn),VP4在輪狀病毒入侵進(jìn)入小腸上皮中起著關(guān)鍵作用,同時表達(dá)VP2、VP4、VP6和VP7的病毒樣顆粒能夠更加有效的進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞,提高黏膜免疫水平和系統(tǒng)免疫水平;此外,前期工作還表明,將全長EV71 VP1替換掉RV-VP2 N端的92個氨基酸后,融合蛋白依然能與VP6、VP7包裝成病毒樣顆粒。本研究首先通過PCR技術(shù)獲得了EV71 VP1和RV VP2、VP4、VP6、VP7基因,并將EV71 VP1和截短的RV VP2進(jìn)行融合得到ER1,2基因,將各個目的基因分別克隆至轉(zhuǎn)移載體pYBDM-IM和pUCDM-XIGP,然后運(yùn)用Multibac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建同時攜帶EV71 VP1和RV VP2、VP4、VP6、VP7的重組桿狀病毒,轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,觀察到紅色熒光和綠色熒光,并在細(xì)胞中成功表達(dá)了相關(guān)基因蛋白,利用Western Blot鑒定了蛋白的表達(dá)情況,利用蔗糖密度梯度離心的方法對蛋白進(jìn)行純化,并在透射電鏡下觀察VLPs的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示ER1,2、VP2、VP4、VP6、VP7蛋白大小分別為127 KD、104 KD、88KD、46 KD、38 KD,蛋白條帶較為單一且蛋白大小與預(yù)期一致,由此可見病毒樣顆粒的相關(guān)基因已正確表達(dá)。通過該方法獲得的VLPs并不是分別對腸道病毒樣顆粒和輪狀病毒樣顆粒的制備和純化,再將二者混合,而是制備了嵌合型的雙價病毒樣顆粒,充分發(fā)揮了桿狀病毒多基因表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢,減少生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率。本研究充分利用輪狀病毒樣顆粒的納米特性及其VP2基因能夠攜帶較大外源蛋白的特點(diǎn),將引起手足口病毒重癥的腸道病毒EV71的主要抗原VP1與截短后的輪狀病毒衣殼蛋白VP2融合,同時將RV VP4基因展示在中間層,將RV VP4、VP7基因展示在外層,獲得嵌合型雙價病毒樣顆粒,為制備同時抗手足口病毒和輪狀病毒腹瀉的雙價疫苗奠定了前期的實驗基礎(chǔ)。該研究思路和方法能夠更進(jìn)一步拓展病毒樣顆粒疫苗的設(shè)計思路,對構(gòu)建其他多價病毒樣顆粒疫苗具有借鑒意義,為獲得能同時抗手足口病和輪狀病毒感染性腹瀉的雙價病毒樣顆粒疫苗打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南陽師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

大利亞學(xué)者 Bishop 等最早在腹瀉病人的十二指腸中發(fā)現(xiàn)了一人類輪狀病毒[6]。毒粒子在電子顯微鏡下呈球狀，沒有被膜[7,8]，為二十面體對密六角型核心，即為芯髓。完整的輪狀病毒顆粒直徑約 70 nm包繞，其中結(jié)構(gòu)蛋白 VP1、VP2、VP3 基因構(gòu)成內(nèi)層衣殼，V，VP4、VP7 基因構(gòu)成外層衣殼。因組是由 11 個分節(jié)段的雙鏈 RNA 片段組成，其中第 11 基因 NSP6 兩個蛋白，其他基因片段分別編碼一個蛋白，分別是 V構(gòu)蛋白和 NSP1~4、NSP5、NSP6 六個非結(jié)構(gòu)蛋白[9-11]。VP6清群分類的重要依據(jù)，根據(jù)其抗原性的不同，可分為 A~ G 七以 A 群輪狀病毒危害最為嚴(yán)重，幾乎每個兒童在 5 歲以前都也是全世界研究學(xué)者最為關(guān)注的[12-14]。

不同的病毒流行株引起的臨床癥狀也不盡相同，EV不同國家和不同年份中也不一致，目前尚不能清楚了解病毒基間的關(guān)系，也缺乏可用于致病機(jī)理與疫苗評價的動物模型，這要課題。 基因組的全長為 7500 bp 左右，僅有一個開放閱讀框（open re表達(dá)一個約 2200 個氨基酸的多聚蛋白。ORF 是由一個結(jié)構(gòu)蛋 P2 和 P3 區(qū)域組成。結(jié)構(gòu)蛋白 P1 編碼的結(jié)構(gòu)蛋白（VP1~VP非結(jié)構(gòu)蛋白 P2 和 P3 編碼的多肽蛋白負(fù)責(zé)病毒的復(fù)制[41]。研EV71 中只有一個普遍中和的抗原決定基，即 VP1 上的一個線區(qū)域是主要的中和決定因子，因此 EV71 病毒衣殼蛋白 VP1 區(qū)性，被作為人腸道病毒屬血清型分類的依據(jù)，成為 EV71 基因重要對象[42]。

南陽師范學(xué)院碩士學(xué)位論文篩選和劃線驗證的方法得到陽性菌液，再以該菌液為菌株制備 Am 感受態(tài)細(xì)胞，最后將 pFBDMΔspeI-IM-ph-VP7-p10-VP4 導(dǎo)入其中。由于 pFBDM 載體的轉(zhuǎn)座效率高于pUCDM 的轉(zhuǎn)座效率，因此本實驗采用了第一種策略，成功獲得了重組桿狀病毒BV-RV2/4/6/7 和 BV-ER1,2-RV4/6/7 的陽性菌液。構(gòu)建的重組桿狀病毒攜帶多個外源基因的表達(dá)盒示意圖見圖 2-1。
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本文編號：2856938