2013年,我國華東地區(qū)出現(xiàn)了新型H7N9禽流感病毒疫情。截止到2017年,我國累計(jì)報(bào)告人感染H7N9禽流感病例共1398例,死亡約500人,病例覆蓋我國20多個(gè)省市地區(qū)。盡管國家采取了一系列的疾病防控措施,但是H7N9禽流感病毒致人發(fā)病的病例至今仍有散在發(fā)生。面對如此嚴(yán)峻的形勢,對于安全且高效的新型禽流感疫苗的研制開發(fā),成為H7N9亞型禽流感防控的關(guān)鍵。病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)是一種新型的基因工程疫苗,它具有安全性高、免疫效果好以及不易失活等優(yōu)點(diǎn),使其在病毒疫苗開發(fā)中具有重要的研究意義。目前全世界已有大量關(guān)于VLPs的研究報(bào)道,其中人類乳頭瘤病毒樣顆粒(HPV VLPs)疫苗已經(jīng)成功上市,預(yù)示著病毒樣顆粒疫苗具有廣闊的市場前景。禽流感病毒樣顆粒疫苗不含病毒核酸,使用時(shí)沒有生物安全風(fēng)險(xiǎn),而且可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫并對同型的異源病毒提供免疫保護(hù),是目前最有希望替代現(xiàn)有禽流感疫苗的候選疫苗。因此,禽流感病毒樣顆粒疫苗的研制具有極為重要的科學(xué)價(jià)值和社會(huì)效益。本研究首先對我國H7N9亞型禽流感病毒流行狀況進(jìn)行廣泛流行病學(xué)調(diào)查,然后在此基礎(chǔ)上篩選出流行毒株作為疫苗用毒株,將其主要結(jié)構(gòu)蛋白HA基因、NA基因和M1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化和全基因合成作為抗原基因,然后將HA基因和M1基因通過常規(guī)酶切克隆方法連接到pYBDM-IM轉(zhuǎn)移載體中,將NA基因通過常規(guī)酶切克隆方法連接到pUCDM-XIGP轉(zhuǎn)移載體中,將得到的重組轉(zhuǎn)移載體通過酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)特異性目的條帶,說明重組轉(zhuǎn)移載體已經(jīng)構(gòu)建成功,并將其測序進(jìn)一步驗(yàn)證抗原基因是否正確。將驗(yàn)證正確的兩種轉(zhuǎn)移載體pYBDM-IM-HA-M1和pUCDM-XIGP-NA,通過轉(zhuǎn)座和位點(diǎn)特異性重組的方法同時(shí)重組到SW106Am/asd~-/InvC~+感受態(tài)細(xì)胞中,采取抗性篩選、藍(lán)白斑篩選和菌液PCR等方法篩選陽性重組菌液,將得到的陽性重組菌液命名為Am-HA-NA-M1-IM-XIGP。將重組菌液采用本實(shí)驗(yàn)室建立的細(xì)菌感染方法直接感染Sf9昆蟲細(xì)胞,收獲重組病毒BV-HA-NA-M1-IM-XIGP,因?yàn)橹亟M病毒同時(shí)攜帶GFP和mCherry兩種報(bào)告基因,因此在熒光顯微鏡下可以同時(shí)觀察到紅色熒光和綠色熒光。收集病毒感染的Sf9細(xì)胞上清提取病毒基因組DNA,并利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行檢測,結(jié)果表明基因組DNA均PCR擴(kuò)增出特異性目的條帶,這說明HA基因、NA基因和M1基因已經(jīng)成功重組至桿狀病毒基因組中;另外,收集病毒感染的Sf9細(xì)胞沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定,用三種目的基因各自攜帶標(biāo)簽的特異性抗體檢測HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)63KD、53KD和29KD的蛋白條帶,說明H7N9亞型禽流感的HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中成功得到表達(dá)。將重組病毒大量感染Sf9昆蟲細(xì)胞,5天后收集病毒感染細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)純化,然后將純化的蛋白質(zhì)置于透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)直徑大小為80~120nm的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。這說明,M1、NA和HA蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中得到了很好地表達(dá),并且組裝成了VLPs結(jié)構(gòu)。這進(jìn)一步說明了,本研究成功利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)了H7N9亞型禽流感病毒樣顆粒,為以后生產(chǎn)和制備H7N9亞型禽流感疫苗提供了技術(shù)支撐。
【學(xué)位單位】：南陽師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R373.13;S852.65
【部分圖文】：

亞型禽流感病毒概述感病毒的流行與分類病毒一般只感染禽類或其它動(dòng)物，禽流感就是由于動(dòng)物感染禽流感一類普遍流行的傳染性疾病。如果禽流感傳染到人群中，最初可能感冒現(xiàn)象，如咳嗽、發(fā)熱等癥狀，病情較重則可以產(chǎn)生肺炎，當(dāng)病死亡[7]。H7N9 亞型禽流感病毒是于 2013 年春季在我國的上海、安現(xiàn)的，在此之前我國的法定報(bào)告?zhèn)魅静”O(jiān)測報(bào)告系統(tǒng)中并未包含該發(fā)現(xiàn)的流感病毒，是我國乃至全世界首例，而本次疫情發(fā)生后的次應(yīng)疫苗予以應(yīng)對，說明此次疫情較為緊急，應(yīng)對難度較大。根據(jù)相該病毒主要由于亞洲東部以及我國東部和東南沿海地區(qū)禽類基因重13 年 3 月至 5 月末所發(fā)生的禽流感疫情導(dǎo)致 131 人感染，其中 37 人病情因得到及時(shí)有效的救治而得以生還[9]。H7N9 亞型禽流感病毒結(jié)

一種是棒狀存在的血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）所組成[26]；另外一種是蘑菇狀存在的神經(jīng)氨酸酶蛋白（neuromin同源的四聚體所組成（圖 1-2）[26]。其中血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（流感病毒的 2 種重要抗原，在甲型禽流感病毒中 HA 具有 16 種亞），而 NA 具有 9 種亞型抗原（N1~N9）[26-30]。甲型禽流感病毒中 2組合，就可以構(gòu)成不同種類類型的血清型甲型流感病毒，從而也決主的影響以及毒力大小能力的不同[26]。因此在世界衛(wèi)生組織（WH離的流感病毒株中，對于完整的病毒命名規(guī)則規(guī)定應(yīng)包括：型別/略）/分離地點(diǎn)/序號(hào)/分離年代，最后則需在括號(hào)中標(biāo)明出 H，N 亞：2009 年，美國加利福尼亞州所分離得到的新型人感染的甲型 H1N株命名為 A/California/04/2009（H1N1）[26]。

利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)組裝 H7N9 亞型禽流感病毒樣顆粒的研究液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000~1500 rpm 離心 3 min；，加入約 2 mL 培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加 2~3 滴至已加入新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。移載體的構(gòu)建以及其克隆多個(gè)基因方法載體圖譜如下（參考圖 2-1，2-2）：其中 pYBDM 質(zhì)粒為第一CDM 質(zhì)粒為第二種方式供體載體。
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